Introduction
가축이 섭취한 사료는 소화기관을 거치는 동안 효소에 의해 분해되거나 미생물에 의해 발효되어 체내로 흡수되며 가축의 성장에 영향을 준다. 이 중 남은 물질은 분과 뇨로 배설된다(Nahm, 2003). 냄새물질은 대장에서 사료가 발효되거나 축사 내부에 배설된 분뇨가 발효될 때 생산된다. 주요한 냄새물질은 페놀류, 인돌류, 휘발성지방산 및 황화합물이며 양돈 농장에서 불쾌도가 높은
냄새물질은 휘발성지방산, 페놀류, 황화합물 및 질소화합물이다(Le et al., 2005). 이 중 황화합물, 페놀류 및 인돌류는 냄새 강도 및 불쾌도가 높은 물질이며, 주로 단백질 분해에 의해 생산된다(Parker et al., 2013). 돼지 사료 내 탄수화물에 비해 단백질 수준을 높게 공급하면 대장에서 과량의 단백질 발효에 의해 냄새물질 생산이 증가된다. 그러나 이러한 환경적인 문제에도 불구하고 고단백질 사료는 돼지 생산성을 높이기 위해 이용되고 있다. 최근에는 비트펄프, 귀리 및 저항성 전분과 같이 발효탄수화물이 풍부한 원료를 단백질 수준에 맞게 첨가하여 가축에 급여하고 있다(Yang et al., 2013). 발효탄수화물은 장내 미생물의 성장과 활동을 조절하여 가축에게 유익한 물질을 생산하게 하고 생산성 향상에 영향을 주는 것으로 알려져 있다(Nahm, 2003). 돼지 사료에 발효탄수화물을 첨가하여 급여하면 장내 탄수화물 발효를 높이고 상대적으로 단백질 발효를 감소시켜 냄새물질의 생산을 조절할 수 있다(De Lange et al., 2010). 팜박은 팜 열매에서 오일을 추출한 후 남은 부산물로 말레이시아에서 연간 215만톤이 생산되고 있으며, 국내에서는 5.8 만톤/월이 사용되고 있다. 팜박은 조단백질 14 - 16% 및 조섬유 16 - 20%가 함유되어 있고 섬유질은 주로 만난(35 - 40%)의 형태로 구성되어 있다(Alimon, 2004). 주로 반추동물의 사료로 이용되고 있으며(Singhania et al., 2008), 최근에는 돼지와 닭 사료의 섬유질원으로 이용되고 있다(Ravindran and Blair, 1992; Sulabo et al., 2013). 팜박에 함유된 발효탄수화물은 장내 박테리아의 활성을 높이고 유익한 물질을 생성할 수 있게 하여 장내 발효환경을 개선시킴으로써 분뇨 내 냄새물질의 생산을 조절할 수 있을 것으로 판단된다. 현재 팜박을 이용한 연구는 주로 가축의 생산성 및 육질에 대한 영향성 평가에 관해 수행되었으며, 가축의 장내 발효환경 조절에 의한 분뇨 내 냄새물질 저감 및 미생물 군집 변화를 함께 수행한 연구는 드물다. 본 연구는 돼지 사료에 팜박을 첨가하여 급여하였을 때 생산성, 육질, 분뇨 내 냄새물질 농도 및 미생물 군집의 변화를 조사하였다.
Materials and Methods
시험 설계 및 시험축
시험구는 사료 내 팜박 첨가 3수준(0%, 2% 및 4%)으로 구성되었으며 처리구 당 8두의 돼지를 배치하였다. 시험축은 평균 개시 체중 51.36 ± 1.02 kg의 비육돈을 이용하였다. 돼지는 플라스틱 슬랏 바닥으로 되어있고 온도와 환기가 자동으로 조절되는 돈사에서 사육되었다.
사료 급여, 성장률 측정 및 분뇨시료 채취
돼지는 10일간 돈방과 시험 사료에 적응되었으며, 시험은 총 60일간 수행되었다. 시험 사료는 돼지 성장단계에 맞는 영양소 요구량으로 배합하여(Table 1 ) 자유채식으로 급여되었으며, 매일 사료섭취량을 측정하였다. 시험 개시와 종료 시에 돼지 체중을 측정하여 일당증체량을 계산하였다. 냄새물질 분석을 위한 돼지 분뇨는 처리구별로 분리된 돈방 바닥 아래의 피트에서 회 당 약 100 mL씩 총 4회 채취되었으며, 박테리아 군집 분석을 위한 돼지 분은 돼지를 도축한 후 대장 내에서 처리구별로 약 50 g씩 채취되었다.
육질 분석
육질 분석에 사용된 돼지 도체는 4℃에서 24시간 저장한 후 반도체 등심 부위를 분할 정형한 후 5번째와 6번째 늑골 사이의 등심부위를 채취하여 도체 무게, 도체 등급 및 등지방 두께를 측정하였다. 육색은 Chromameter (Model CR-210, Minolta Co., Japan)를 이용하여 측정하였으며, 이때 표준 색판은 L* = 89.2, a* = 0.921, b* = 0.783으로 하였다. 또한 NPPC (1991) 기준에 의거하여 관능검사요원에 의해 육색, 근내지방도 및 경도를 측정하였다.
냄새물질 분석
페놀류 및 인돌류 분석을 위해서 분뇨 4 mL에 4 M 수산화나트륨(Sigma-Aldrich, USA) 50 µL와 디클로로메탄 원액(Merck, Germany) 4 mL을 첨가하여 혼합한 후 원심분리기를 이용하여 디클로로메탄 층을 분리하였다. 분리된 용액은 DB-1 컬럼(30 m × 0.25 mm × 0.25 µm, Agilent, USA)과 FID(flame ionization detector)가 장착된 가스크로마토그래피(6890N, Agilent, USA)를 이용하였고 주입구와 검출구의 온도는 250℃ 그리고 split ratio는 5:1로 설정하여 분석되었다. 휘발성지방산(단쇄지방산, 이성체지방산)을 분석하기 위해서 분뇨 5 mL에 25% 인산(Sigma-Aldrich, USA) 용액 1 mL을 첨가하여 혼합한 후 원심분리기를 이용하여 상층액을 분리하였다. 상층액은 0.2 µm 필터(Whatman, Sweden)를 이용하여 불순물을 제거한 후 HP-INNOWax 컬럼(30 m × 0.25 mm × 0.25 µm, Agilent, USA)과 FID가 장착된 가스크로마토그래피(6890N, Agilent, USA)를 이용하여 분석되었다. 이때 주입구와 검출구의 온도는 250℃ 그리고 split ratio는 10:1로 설정하였다.
박테리아 군집 분석
1) PCR 분석 조건
PCR 증폭을 위해 필요한 genomic DNA는 Fast-DNA spin kit (MP bio, USA)를 이용하여 분리하였고, 휴믹산은 Power-Clean DNA Clean-Up kit (MP bio, USA)를 이용하여 제거하였다. V1에서 V3의 변이부위가 존재하는 500 - 700 bp의 박테리아 16S ribosomal RNA (16S rRNA) 유전자는 바코드 프라이머 세트를 이용하여 증폭되었다. PCR 증폭 조건은 1단계로 95℃에서 5분간 유지한 후 2단계로 95℃에서 30초, 55℃에서 30초, 72℃에서 30초간의 사이클을 30회 반복한 후 3단계로 72℃에서 7분간 유지한다.
2) 파이로시퀀싱 및 박테리아 군집 분류
파이로시퀀싱은 454 GS FLX 티타늄 시퀀싱 시스템(Roche, USA)으로 분석하였으며, 본 실험은 천랩(Seoul, Korea)에서 수행하였다. 분석된 시퀀스는 UCHIME program (Edgar et al., 2011)을 이용하여 97% 이상의 정확도를 가지는 부분을 분리한 후 EzTaxon-e database를 이용하여 박테리아를 분류하였다(Kim et al., 2012). OTUs (Operational taxonomic units)는 CD-HIT program으로 정리하였고, Chao1, Shannon-Weaver, Simpson 및 Goods library coverage는 Mothur package로 계산하였다(Schloss et al., 2009).
통계 분석
실험 결과는 SAS (SAS, 2002) 프로그램을 이용하여 GLM (General linear model)의 분산분석으로 통계 처리되었다. 처리구 평균 간의 차이는 Duncan (1955)의 다중검정법에 의한 95% 유의수준으로 분석하였다.
Results and Discussion
팜박 첨가사료가 돼지 성장률 및 육질에 미치는 효과
돼지 사료에 팜박을 0%, 2% 및 4% 첨가하여 급여한 후 돼지 성장률 및 육질을 분석하여Table 2에 정리하였다. 돼지의 성장률 및 육질은 처리구간에 차이가 없었다(p > 0.05). Jaworski et al. (2014)의 연구에서, 비육돈 사료에 팜박을 5% 첨가하여 급여하였을 때 팜박 무첨가구에 비해 성장률 및 육질이 처리구간에 차이가 없었다. 반면 본 연구결과와 달리, Ao et al. (2011)의 연구에서는 비육돈 사료에 팜박을 첨가하지 않은 처리구에 비해 팜박을 5% 첨가하여 급여하였을 때 평균 일당증체량(ADG; average daily gain)과 사료효율(gain/feed ratio)이 감소된 결과를 보였다. 또한 비육돈 사료에 팜박 2% 또는 4%를 첨가하여 급여하였을 때, 평균 일당증체량은 팜박 무첨가구에 비해 팜박 4% 첨가구에서 감소되었지만 팜박 2% 첨가구에서는 유의적인 차이가 없었다(Kim et al., 2001). 그러나 두 연구에서 육질은 처리구간에 차이가 없었다. 사료 내 팜박을 적절한 수준으로 첨가하여 급여하면 돼지 성장률 및 육질의 감소에 영향을 주지 않을 것으로 판단된다(Seo et al., 2015).
팜박 첨가사료가 돼지 분뇨 내 페놀류, 인돌류 및 휘발성지방산 농도에 미치는 효과
돼지 사료에 팜박을 0%, 2% 및 4% 첨가하여 급여한 후 돈사 피트에서 분뇨를 채취하여 페놀류, 인돌류 및 휘발성지방산 농도를 분석하였으며, 그 결과를 Table 3에 정리하였다. 사료 내 팜박을 첨가하지 않은 처리구(팜박 0%)보다 팜박을 첨가한 처리구(팜박 2% 및 4%)에서 페놀류 및 인돌류 농도가 유의적으로 감소되었다(p < 0.05). 특히 팜박 2% 처리구가 팜박 0% 처리구에 비해 페놀류 35% 및 인돌류 34%가 감소되었다. 팜박에는 돼지 장내 미생물의 성장을 위한 에너지원인 비전분성 다당류(Non-starch polysaccharides; NSP)가 많이 함유되어 있으며(Montagne et al., 2003), 이 중 78%가 만난이다(Dusterhoft et al., 1992). 비전분성 다당류와 같은 발효탄수화물은 가축의 장내 발효환경을 개선하여 분뇨 내 냄새물질의 생산을 조절할 수 있다(De Lange et al., 2010). 돼지의 대장에는 발효탄수화물이 소량으로 존재하기 때문에 장내 미생물은 단백질을 에너지원으로 이용함으로써 냄새물질을 생산하게 된다. 사료 내 발효탄수화물을 첨가하여 급여하면 장내 미생물은 에너지원으로 단백질 대신 발효탄수화물을 이용하게 되어 단백질 분해에 의한 냄새물질의 생산을 줄일 수 있다(Cummings and Macfarlane, 1991). 페놀류와 인돌류는 단백질이 분해되어 생산된다. 돼지가 발효탄수화물이 첨가된 사료를 섭취하였을 때 분뇨 내 p-크레졸과 스카톨의 농도가 감소되었다(Goa et al., 1999). 또한 비전분성 다당류가 첨가된 사료를 섭취한 돼지가 사육된 돈사의 공기에서도 p-크레졸, 인돌 및 스카톨의 농도가 감소되는 연구결과도 있다(Willig et al., 2005). 본 연구에서 돼지 사료 내 팜박을 첨가하여 급여하였을 때 페놀류 및 인돌류 같이 단백질 유래 냄새물질의 농도가 감소된 것은 팜박에 함유된 발효탄수화물에 영향을 받았을 것으로 판단된다. 반면 팜박 4% 처리구가 팜박 2% 처리구에 비해 분뇨 내 페놀류 및 인돌류의 농도가 높은 경향을 보였는데(p < 0.05), 사료 내 단백질 및 다른 발효탄수화물의 양을 고려하지 않고 발효탄수화물을 첨가하면 오히려 냄새물질이 생산될 수 있다(Overland et al., 2011). 돼지 사료에 팜박 첨가수준에 따른 분뇨 내 휘발성지방산 농도를 비교하였을 때 팜박 4% 처리구가 팜박 0% 처리구에 비해 발레르산의 농도가 높은 경우(p < 0.05)를 제외하면 처리구간에 유의적인 차이가 없었다(p > 0.05). 발효탄수화물은 장내 박테리아를 활성화시키고 휘발성지방산을 생산하게 한다. 휘발성지방산은 장내 박테리아의 중요한 에너지원으로 이용될 수 있으며(Mackie et al., 1998), 발효탄수화물에 의해 박테리아의 활성이 높아지면 대장 상피세포로 잘 흡수된다(Yu et al., 2016). 돼지 분뇨의 냄새물질 저감 효과는 발효탄수화물의 종류 및 첨가수준에 따라 차이가 있기 때문에(Wang et al., 2004; Yang et al., 2013) 사료에 팜박을 2% 수준으로 첨가하여 급여하면 분뇨 내 페놀류 및 인돌류의 농도를 감소시킬 수 있다.
팜박 첨가사료가 돼지 분뇨 내 박테리아 군집에 미치는 효과
1) 파이로시퀀싱 결과
사료 내 팜박 첨가구(2%)와 무첨가구(대조구)의 돼지 분 내 박테리아 군집의 차이를 다중 바코드 파이로시퀀싱 기법을 이용하여 분석하였다. 그 결과(Table 4), OTUs, Chao1, Simpson, Shannon-Weaver와 같이 박테리아 다양성과 종 풍부도 지표의 경우 대조구에 비해 팜박 첨가구가 높은 경향을 보였다. 이것은 팜박에 함유된 발효탄수화물이 장내 미생물의 에너지원으로 이용되면서 다양한 미생물의 성장을 유도한 것으로 판단된다(Mosenthin et al., 2001).
2) 박테리아 군집 구성
사료 내 팜박 첨가구와 무첨가구의 돼지 분 내 박테리아 군집 구성을 문과 속의 단위로 정리하였다(Fig. 1 and Fig. 2). 총 23개의 문이 분석되었으며, 이 중 주요한 10개의 문은 Firmicutes, Bacteroidetes, Proteobacteria, Tenericutes, Lentisphaera, Actinobacteria, Fibrobacteres, TM7, Cyanobacteria 및 Spirochaetes로 분석되었다(Fig. 1). Firmicutes는 돼지 분에 가장 높은 비율(80% 이상)로 존재하였으며 Bacteroidetes (5 - 10%)와 Proteobacteria (1 - 3%)가 다음으로 높은 비율이었다. Firmicutes의 비율은 대조구(91%)에 비해 팜박 첨가구(84%)에서 낮았지만 Bacteroidetes와 Proteobacteria의 비율은 대조구(6%와 1%)에 비해 팜박 첨가구(10%와 3%)에서 높았다. 사료 내 팜박 처리구별로 돼지 분 내 박테리아의 변화를 더 자세하게 분석하기 위해서 박테리아 군집 구성을 속 단위로 정리하였다(Fig. 2). 총 508개의 속이 분석되었으며 이들 속들을 10개의 주요한 문으로 분류하면, 272개 속이 Firmicutes 문, 79개 속이 Proteobacteria 문, 54개 속이 Bacteroidetes 문, 41개 속이 Actinobacteria 문, 13개 속이 Tenericutes 문, 7개 속이 Cyanobacteria 문, 5개 속이 Lentisphaera 문, 4개 속이 Spirochaetes 문, 3개 속이 Fibrobacteres 문 및 2개 속이 TM7 문에 속하였다. 이들 속 중 328개 속이 그람 양성균이고 152개 속이 그람 음성균 이었다. 분석된 속 중에서 상대적으로 비율이 높은 속을 분류하여 사료 처리구간에 비교하였을 때, Firmicutes 문에 속하는 Terrisporobacter, Clostridium, Eubacterium_g23, DQ353929_g, AM982558_g 속의 비율이 대조구에 비해 팜박 첨가구에서 낮았다. 이 중 Terrisporobacter 속과 Clostridium 속이 높은 비율로 존재하는데 Terrisporobacter 속은 Peptostreptococcaceae 과에 속하며 Clostridium 속의 재분류 과정에서 분리되었다(Deng et al., 2015). 이 박테리아는 그람 양성균이고, 주요한 대사산물은 아세트산이며 소량의 프로피온산도 생산한다. 이 박테리아의 많은 특성이 Clostridium 속과 유사하다(Gerritsen et al., 2014). Clostridium 속은 가축 분에 많이 존재하며 대부분의 종이 가축에게 유해한 물질을 생산하는 것으로 알려져 있지만 일부는 셀룰로오스, 자일로스 및 리그노셀룰로오스와 같은 발효탄수화물을 분해하여 대장 환경을 좋게 하는 유익한 물질을 생산한다(Girija et al., 2013). 또한 이 박테리아는 단백질을 분해하여 이성체지방산과 인돌류를 생산한다(Chung et al., 1975). 반면 Firmicutes 문에 속하는 Intestinibacter, AM406061_g, Coprococcus_g2, Phascolarcotobacterium, EF401875_g, Lactobacillus, Streptococcus 속과 Bacteroidetes 문에 속하는 Parabacteroides, Alloprevotella, GU303868_g 속의 비율은 대조구에 비해 팜박 첨가구에서 높았다. Firmicutes 문에 속하는 모든 속들은 섬유소원을 분해하여 휘발성지방산을 생산하며 주로 단쇄지방산을 생산한다(Belenguer et al., 2007; Daly et al., 2012). 이 중 Lactobacillus 속은 사람이 사과를 먹기 전에 비해 먹은 후에 분 중의 비율이 높아졌으며(Shinohara et al., 2010), 돼지가 일반 배합사료를 섭취하였을 때보다 귀리-베타글루칸이 첨가된 사료를 섭취하였을 때 분 중의 비율이 높아졌다(Metzler-Zebeli et al., 2011). Bacteroidetes 문 중 높은 비율을 차지하는 Parabacteroides 속은 Bacteroides 속과 유사한 특성을 가지고 있다(Karlsson et al., 2011). Bacteroides 속은 다양한 효소를 분비하여 탄수화물과 단백질을 분해할 수 있으며(Gaskins, 2001), 휘발성지방산, 페놀류 및 인돌류 등 다양한 대사산물을 생산할 수 있다(Davila et al., 2013). 돼지 분뇨 내 냄새물질 농도와 박테리아 군집의 비율은 사료 내 함유된 발효탄수화물의 종류와 첨가 수준에 따라 변화될 수 있다(Nahm, 2003). 사료에 첨가한 팜박에 의해 장내 탄수화물 발효는 증가되고 상대적으로 단백질 분해가 감소되면서 냄새물질 농도와 박테리아 군집의 비율의 변화에 영향을 준 것으로 판단된다(Cummings and Macfarlane, 1991). 발효탄수화물을 이용하여 분뇨의 냄새물질을 조절하기 위해서는 종류 및 적절한 첨가수준을 선정하여 공급하는 것이 중요하다.
Conclusion
본 연구는 돼지 사료에 팜박 0%, 2% 및 4% 첨가하여 급여한 후 돼지 성장률, 육질, 분뇨 내 냄새물질 농도 및 분 중 박테리아 군집의 변화를 조사하였다. 돼지의 성장률과 육질은 팜박 첨가수준 간에 차이가 없었지만, 분뇨 내 페놀류 및 인돌류 농도는 팜박 2% 처리구가 팜박 0% 처리구에 비해 페놀류 35% 및 인돌류 34%가 감소되었다. 이때 분 중 박테리아는 Firmicute 문에 속하며 주로 섬유소원을 분해하는 박테리아 속의 비율이 팜박 무첨가구에 비해 팜박 첨가구에서 증가되었다. 이것은 사료 내 팜박에 의해 장내 탄수화물 발효가 증가되고 상대적으로 단백질 분해가 감소되면서 영향을 받은 것으로 판단된다. 본 연구결과를 종합하면 돼지 사료에 팜박을 2% 수준으로 첨가하여 급여하면 돼지 분뇨 내 페놀류 및 인돌류의 농도를 감소시킬 수 있으며 돼지의 성장 및 육질의 감소에는 영향을 주지 않을 것으로 판단된다.
