Simultaneous analysis of anthocyanins and flavonols in various flower colors of Rhododendron schlippenbachii (royal azalea)

Introduction

진달래과(Ericaceae) 진달래속(Rhododendron)에는 전 세계에 600여종이 생육하고 있고, 우리나라에는 만병초, 진달래, 철쭉, 참꽃나무 등 약 22종이 생육하고 있다(Kim, 2006). 본 속 식물들에 대한 성분 연구로는 페놀산(phenolic acids), 테르페노이드(terpenoid), 디테르펜(diterpene),

플라보노이드(flavonoids), 안토시아닌(anthocyanins)과 같은 항산화 물질, 무기질 등이 분리, 보고되었다(Han, 2006; Mizuta et al., 2009).

철쭉꽃은 5월 무렵 3 - 7개씩 가지 끝에 피는데, 향기가 풍부하다. 꽃잎이 다섯 갈래로 갈라져 나며 아랫부분이 함께 붙은 통꽃이다. 꽃잎의 안쪽에는 선명한 반점이 주근깨처럼 난다. 잎도 꽃이 피면서 같이 자라는데 잎이 진한 초록색으로 변할 무렵에 꽃이 지며 통꽃잎이 그대로 떨어진다(Natural Parks of Korea, 2009).

안토시아닌(anthocyanins)은 수용성 플라보노이드로 식물의 잎, 꽃 등 적색에서 청색에 이르는 다양한 색을 발현하며 아글리콘(aglycone)인 안토시아니딘과 당 또는 유기산이 결합되어 있다(Andersen and Jordheim, 2006; Choi, 2010). 식물체 내 6가지 안토시아니딘은 cyaniding (50%), pelargonidin (12%), delphinidin (12%), peonidin (12%), malvidin (7%), petunidin (7%)의 순으로 분포되어 있다(Kong et al., 2003). 안토시아닌의 형태와 색의 강도는 methoxyl기가 많아지면 더욱 빨간색을 띠게 되고 hydroxyl기가 많아지면 더욱 푸른색이 짙어진다(Castaneda et al., 2009). 일반적으로 cyanidin과 peonidin 유도체들은 각각 빨간색과 주황색을 나타내는 반면, delphinidin 유도체들은 보라색 또는 청색을 띤다(Delgado and Paredes, 2003). 특히 cyanidin, pelargonidin, delphinidin 배당체는 기준색소가 된다(To and Wang, 2006).

플라보노이드는 액포에 존재하는 2차 대사산물로서 플라본(flavone)을 기본구조의 골격으로 한 수용성 식물 색소이며 플라본류(flavones), 플라보놀류(flavonols), 이소플라본(isoflavone), 칼콘(chalcone), 오론(aurone), 안토시아닌(anthocyanin) 등을 총칭한다(To and Wang, 2006). 그렇지만 안토시아닌은 채소나 과일의 기능성 평가뿐만 아니라 다양한 꽃색 육종을 위하여 세계적으로 많은 연구를 하고 있기 때문에 플라보노이드와 별도로 취급하는 경우가 많다.

식물체 내에서 플라보놀(flavonols)은 phenylpropanoid 경로로부터 생합성되며, 주요 아글리콘으로 6종류(quercetin, myricetin, kaempferol, isorhamnetin, apigenin, luteolin)가 있다(Crozier et al., 2000). 식물 조직에서 플라보놀과 중합(conjugation)을 이루는 주요 당으로는 glucose, rhamnose, rutinose가 있으며 주요 중합은 B-ring의 3위치에서 일어나고 7, 4’위치에서도 빈번히 일어난다(Crozier et al., 2000).

현재까지 국내에서 Rhododendron 속 꽃에 대한 연구는 페놀산, 테르페노이드, 플라보노이드에 집중(Han, 2006)되었으며 철쭉꽃에서 안토시아닌으로 malvidin 3-arabinoside-5-glucoside, 플라보노이드로 myricetin 3-O-β-D-glucoside, quercetin 3-galactoside, quercetin 3-glucoside, kaempferol 3-rhamnoside 등이 동정 및 보고되어 있다(Li et al., 2008). 따라서 본 연구는 국내에서 아직까지 보고되지 않은 다양한 철쭉꽃 내 안토시아닌 및 플라보놀 성분의 동정 및 정량에 대해 구명하고자 하였다.

Materials and Methods

시약

HPLC-grade methanol (CH₃OH)과 acetonitrile (CH₃CN)은 J.T. Baker Chemical Co. (New Jersey, USA) 것을 사용하였다. Formic acid (HCOOH)는 Acros Organics (New Jersey, USA)에서 구입하였다. 안토시아닌 표준물질[cyanidin 3, 5-O-diglucoside, peonidin 3-O-glucoside chloride]은 Extrasynthese (Genay, France)것을 사용하였다. 플라보놀 표준물질(quercetin)은 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다.

철쭉꽃 채집

2014년 5월 1일, 충남대학교 KT&G 앞 화단(36°22'07.3" N, 127°20'58.9" E, 78.97 m)에서 7가지[흰색(white); 빨간색 그룹(red group): 분홍색(pink), 진분홍색(deep pink), 빨간색(red); 보라색 그룹(purple group): 연보라색(light purple), 보라색(purple), 진보라색(deep purple)]의 철쭉꽃을 채집하였다(Fig. 1). 채집한 철쭉꽃은 한국조경수협회(대전, 한국)를 통해 감정을 받아 철쭉꽃임을 확인하였다.

안토시아닌 및 플라보놀 추출

채집한 철쭉꽃은 -70°C 급속 저온 냉동고에 보관하여 동결 건조시킨 다음 막자와 막자사발을 이용해 분말화 하였다. 건조시킨 분말시료(100 mg)를 칭량하여 2.0 mL-Eppendorf tube에 넣고 5% 개미산(formic acid, v/v)을 포함한 3차 증류수(2 mL)를 넣었다. 시료를 진동혼합(vortex)을 한 다음 초음파분산기(sonicator)를 통해 20분간 초음파처리(sonication)를 하였다. 원심분리(12,000 rpm, 15 min, 4°C)한 후, 상층액을 0.45 µm PVDF syringe filter (직경 13 mm)로 여과하였다.

그 다음 Sep-pak Plus C18 Cartridges (Whatman)을 미리 100% MeOH (2.0 mL)로 활성화시킨 후 초순수(2.0 mL)로 씻었다. 앞서 여과한 시료(1 mL)를 넣은 다음 초순수(2.0 mL)로 당 및 이물질을 제거하고 MeOH (2.0 mL)을 넣어 주어 색소를 용출시켰다. 이는 Mizuta et al. (2009)이 건조된 꽃잎을 추출용액을 이용해 소량 농축시킨 후 Sep-paks C18 Cartridges를 사용한 것과 유사하다.

용출된 색소를 질소 농축기로 MeOH이 완전히 제거될 때까지 (약 50 - 60분 소요) 농축시켰다. 추출용매(0.5 mL)에 녹여 0.45 µm PVDF syringe filter (직경 13 mm)로 여과한 후 HPLC용 갈색 vial병에 넣어 냉장 보관하였다.

안토시아닌 및 플라보놀 HPLC 분석

안토시아닌의 분석은 Alliance e2695 HPLC System (Waters Co., Milford, MA, USA)를 사용하였고, 분석 칼럼은 Kinetex XB-C18 column (100 × 4.6 mm I.d., particle size 2.6 µm), 가드 칼럼은 Security Guard Guard Cartridges Kit AQ C18 column (4 × 3.0 mm) (Phenomenex, Torrance, CA, USA)를 사용하였다. 칼럼 온도는 40°C, 검출 파장(detection wavelength)은 520 nm와 350 nm, 유량(flow rate)은 0.6 mL․min^-1로 설정하였다. 시료는 automatic injector를 사용하여 10.0 µL 주입하였다. 용매 A [water : formic acid = 95 : 5 (v/v)]와 용매 B [formic acid : water : acetonitrile = 5 : 47.5 : 47.5 (v/v/v)]를 이동상 용액으로 사용하였다. 용매 B를 처음에 5%로 시작하여 2분까지 유지하다가 15분에 20%로 증가시키고 17분까지 유지하다가 25분에 30%로 증가시키고 28분에 40%로 증가시킨 후에 33분까지 유지하다가 33.1분에 5%로 감소시킨 후에 40분까지 5%로 유지하였다. 각 안토시아닌 및 플라보놀 성분은 표준물질인(안토시아닌: cyanidin 3, 5-O-diglucoside, peonidin 3-O-glucoside chloride; 플라보놀: quercetin)의 HPLC peak 면적과 각 성분의 면적을 비교하여 정량(mg․g^-1 dry weight, DW)하였다. 철쭉꽃 시료를 분석한 결과, 안토시아닌 및 플라보놀의 피크가 가장 분리가 잘 되는 방법을 분석방법으로 선택했다.

안토시아닌 및 플라보놀 UPLC-Q-TOF/MS 분석

PDA detector를 장착한 Acquity Ultra Performance Liquid Chromatographic System (Waters Co., Milford, MA, USA)을 사용하였고, Xevo G2-S Q-TOF Mass Spectrometer (Waters Co.)를 사용하여 positive ion mode ([M+H]⁺)로 분석하였다. 분석 칼럼은 Kinetex XB-C18 column (150 × 2.1 mm I.D., particle size 1.7 µm)을 사용하였다(Phenomenex Inc, CA, USA). 칼럼 온도는 30°C, 검출 파장(detection wavelength)은 520 nm (안토시아닌)와 350 nm (플라보놀), 유량(flow rate)은 0.2 mL․min^-1로 설정하였다. 시료는 automatic injector를 사용하여 10.0 µL 주입하였다. 용매 A [water : formic acid = 98 : 2 (v/v)]와 용매 B [acetonitrile : formic acid = 98 : 2 (v/v)]를 이동상 용액으로 사용하였다. 처음에 용매 B 5%로 시작하여 10분에 20%로 증가시키고 15분에 40%로 증가시키고 18분까지 유지하다가 20분에 5%로 감소시킨 후에 25분까지 5%로 유지하였다. 모세관압력(capillary voltage)은 3.5 kV, 콘압력(cone voltage)은 30 V으로 설정하였고, 커튼가스(curtain gas)는 N₂로 1050 L/h이었으며 탈용매화 온도(desolvation temperature)는 500°C, 시료 온도(source temperature)는 120°C, 스캔범위(scan spectra)는 m/z 100 - 1,500로 설정하였고, 스캔시간(scan time)은 1.0 s로 하였다.

통계분석

HPLC 분석 결과는 Microsoft Office Excel 2010을 이용하여 각 성분에 대한 함량의 평균값과 반복(n = 3)의 표준편차(SD, standard deviation)를 구하였다.

Results and Discussion

철쭉꽃 내 안토시아닌 분리 및 동정

철쭉꽃 내 HPLC와 UPLC-Q-TOF/MS 분석을 통해 안토시아닌을 분리, 동정하였고 분석하였다. Li et al. (2008)은 Rhododendron 속 꽃에서 HPLC-ESI-MS을 이용해 안토시아닌으로 malvidin 3-arabinoside-5-glucoside을 분리 및 동정하였다. 또한 Hang et al. (2011)은 HPLC을 이용해 cyanidin 3-galactoside, cyanidin 3-arabinoside 등을 밝힌 바 있다. 본 연구결과, 7종류의 안토시아닌(cyanidin 3-O-diglucoside, cyanidin 3-O-arabinoside-5-O-glucoside, cyanidin 3-O-galactoside, peonidin 3-O-arabinoside-5-O-glucoside, cyanidin 3-O-glucoside, cyanidin 3-O-(6"-O-malonyl) arabinoside, cyanidin 3-O-(6"-O-coumaroyl) glucoside)을 동정하였다(Table 1).

Cyanidin 3-O-galactoside, cyanidin 3-O-glucoside은 분자량 m/z 449 [M+H]⁺이 동일하므로 검출 순서에 따라(Wu and Prior, 2005a) 3번째 peak를 cyanidin 3-O-galactoside로, 5번째 peak를 cyanidin 3-O-glucoside로 동정하였다(Fig. 2). Peonidin 3-O-arabinoside-5-O-glucoside는 표준물질인 peonidin 3-O-glucoside chloride의 HPLC peak 면적과 비교하여 정량하였고 그 외 성분은 표준물질인 cyanidin 3, 5-O-diglucoside의 HPLC peak 면적과 각 성분의 면적을 비교하여 정량하였다.

철쭉꽃의 색은 유전적인 요인과 관련 있다. Mizuta et al. (2014)은 purple 계열의 철쭉꽃에서는 cyanidin과 delphinidn 색소가, red 계열의 철쭉꽃에서는 cyanidin 색소가 확인됐는데 이는 특정 유전자와 관련 있다고 밝혔다. 한편, 철쭉꽃의 안토시아닌 조성은 야생종과 자연 잡종 자손의 꽃 색에서 같은 경향을 보였다. 또한 야생종의 교차에 의해 새로운 안토시아닌 조성을 갖는 재배종이 생성될 수도 있다(Mizuta et al., 2009).   

철쭉꽃 내 플라보놀 분리 및 동정

HPLC와 UPLC-Q-TOF/MS 분석에 의하여 7종류의 플라보놀(azaleatin 3-O-glucoside, azaleatin 3-O-arabinoside, azaleatin 3-O-rhamnoside, quercetin 3-O-galacatoside, quercetin 3-O-glucoside, quercetin 3-O-arabinoside, quercetin 3-O-rhamnoside)을 동정하였다(Table 2). 이와 같은 결과는 Rhododendron 속 꽃에서 HPLC-ESI-MS을 이용해 myricetin 3-galactoside, myricetin 3-rhamnoside, quercetin 3-galacatoside, quercetin 3-glucoside, quercetin 3-rhamnoside, kaempferol 3-rhamnoside 등의 성분이 밝혀진 것과 유사하다(Li et al., 2008).

Quercetin 3-O-galactoside, quercetin 3-O-glucoside은 분자량 m/z 465 [M+H]⁺이 동일하므로 검출 순서에 따라(Li et al., 2008) 4번째 peak를 quercetin 3-O-galactoside로, 5번째 peak를 quercetin 3-O-glucoside로 동정하였다(Fig. 3).

철쭉꽃에서 anthocyanin과 flavonol의 조성은 다양한 꽃 색에 영향을 미치는데 특히, 플라보놀이 증감하는 것에 따라 무한한 색의 꽃 색을 나타낼 수 있다(Griesbach, 1987). 또한 anthocyanin과 flavonol 사이에 공액 색소화가 일어날 때 착색효과가 일어난다. 플라보놀이 있는 경우 공액 색소화가 일어나고, 플라보놀이 부족할 경우 공액 색소화가 일어나지 못한다(Mizuta et al., 2014).

철쭉꽃 내 안토시아닌 함량

7가지[흰색(white); 빨간색 그룹(red group): 분홍색(pink), 진분홍색(deep pink), 빨간색(red); 보라색 그룹(purple group): 연보라색(light purple), 보라색(purple), 진보라색(deep purple)]의 철쭉꽃에서 7종류의 안토시아닌을 정량하였다(Table 3). 철쭉꽃 내 안토시아닌은 시아니딘, 페오니딘 계열이었으며, 치환기로는 galactose, glucose, arabinose와 같은 3종류의 단당류이었다. Rhododendron 속 red 계열, purple 계열 꽃에서 공통적으로 cyanidin을 함유하고 있는데(Mizuta et al., 2014) 이는 본 결과에서도 확인되었다.

철쭉꽃의 총 안토시아닌 함량범위는 0.00 - 8.07 mg․g^-1 DW로, ‘deep pink’ (8.07 mg․g^-1 DW)이 가장 높았으며, ‘white’에서는 검출되지 않았다. Mizuta et al. (2009)은 흰색 Rhododendron 속 꽃에서 안토시아닌을 감지하지 못하였다고 보고하였는데 본 연구결과와 일치하였다. 반면에 Mizuta et al. (2014)은 흰색 Rhododendron 속 꽃에서 안토시아닌 전구체를 보고하였으며, Bate-Smith (1953)는 Camellia japonica의 흰색 꽃을 염산으로 가하면 붉은색으로 변하는데, 이는 흰색 꽃 안에 류코 안토시아닌이 있기 때문이라고 보고하였다.

철쭉꽃 내 총 안토시아닌 함량은 ‘deep pink’ (8.07)  > ‘red’ (6.37)  > ‘pink’ (5.35)  > ‘deep purple’ (0.78)  > ‘purple’ (0.43)  > ‘light purple’ (0.22 mg․g^-1 DW) > ‘white’ (미검출) 순으로 감소했다. 각 안토시아닌 성분별 함량은 cyanidin 3-O-arabinoside-5-O-glucoside (7.35, 총 함량 대비 34.6%) > cyanidin 3-O-(6"-O-malonyl) arabinoside (5.03, 23.7%) > cyanidin 3-O-glucoside (4.26, 20%) > cyanidin 3-O-galactoside (3.09, 14.5%) > cyanidin 3-O-diglucoside (1.02, 4.8%) > cyanidin 3-O-(6"-O-coumaroyl) glucoside (0.32, 1.5%) > peonidin 3-O-arabinoside-5-O-glucoside (0.16 mg․g^-1 DW, 0.8%) 순으로 감소했다(Fig. 4). Asen and Budin (1966)은 Rhdodendron 속 꽃에서 cyanidin 3-arabinoside- 5-glucoside, cyanidin 3-glucoside, cyanidin 3-galactoside, cyanidin 3-arabinoside, cyanidin 3, 5-diglucoside 등을 분리하였으며 cyanidin 3-arabinoside-5-glucoside를 대표적인 글리코시드로 보고하였다.

빨간색 그룹(‘pink’ + ‘deep pink’ + ‘red’) 함량을 모두 합한 ‘red group’의 안토시아닌 합(sum)은 19.79 mg․g^-1 DW이었으며, 보라색 그룹(‘light purple’ + ‘purple’ + ‘deep purple’) 함량을 모두 합한 ‘purple group’의 안토시아닌 합은 1.43 mg․g^-1 DW이었다. 이 결과는 총 안토시아닌 함량 대비 ‘red group’, ‘purple group’은 각각 93.2, 6.8%를 차지하였고 ‘red group’에서 ‘purple group’보다 약 13.8배 많았다. 시아니딘과 페오니딘 유도체들은 각각 빨간색과 주황색을 나타낸다고 보고되었는데(Delgado and Paredes, 2003) 빨간색과 주황색을 띄는 유도체인 시아니딘, 페오니딘 계열의 안토시아닌 합이 ‘red group’에서 ‘purple group’ 철쭉꽃보다 많은 경향을 보였다. 반면 Mizuta et al. (2009)은 purple group꽃에서 red group보다 여러 가지 안토시아닌 조성이 확인됐고 purple group이 다양한 꽃 색에 영향을 준다고 보고하였으며 이는 본 연구결과와 차이를 나타냈다. 앞서 언급했듯이 이러한 꽃 색에 따른 철쭉꽃의 특징은 유전적 요인과 밀접한 관련이 있으며(Mizuta et al., 2009), 추후보다 꽃 색에 따른 안토시아닌의 조성을 구체적으로 밝히는 연구가 수행되어야 할 것으로 판단된다.

철쭉꽃 내 플라보놀 함량

7가지의 철쭉꽃에서 7종류의 플라보놀을 정량하였다(Table 4). 철쭉꽃 내 플라보놀은 함량범위는 7.60 - 97.78 mg․g^-1 DW로, ‘pink’ (97.78 mg․g^-1 DW)가 가장 높았으며, ‘red’ (7.60 mg․g^-1 DW)에서 가장 낮았다. 철쭉꽃의 색에 따른 총 플라보놀 함량은 ‘pink’ (97.78)  > ‘deep pink’ (63.79)  > ‘deep purple’ (61.98)  > ‘white’ (57.58) > ‘light purple’ (47.06) > ‘purple’ (46.76) > ‘red’ (7.60 mg․g^-1 DW) 순서로 감소하였다. 각 성분별 플라보놀 함량은 azaleatin 3-O-rhamnoside (189.45, 총 함량 대비 49.5%) > quercetin 3-O-rhamnoside (107.78, 28.2%) > azaleatin 3-O-glucoside (21.89, 5.7%) > azaleatin 3-O-arabinoside (21.68, 5.7%) > quercetin 3-O-glucoside (14.66, 3.8%) > quercetin 3-O-arabinoside (13.60, 3.5%) > quercetin 3-O-galacatoside (13.48 mg․g^-1 DW, 3.5%) 순으로 감소했다(Fig. 4). Loose (1970)은 Rhododendron 속 꽃에서 kaempferol 5-methyl ether 3-galactoside, quercetin 3-galactoside, quercetin 3-rhamnoside, azaleatin 3-galactoside, azaleatin 3-rhamnoside, myricetin 5-methyl ether 3-rhamnoside, myricetin 5-methyl ether 3-galactoside and gossypetin 3-galactoside 등을 보고하였는데 플라보이드 성분의 함량에 관한 직접적인 자료는 확인할 수 없었다. 종합적으로 본 연구를 통해 7가지 철쭉꽃에서 총 플라보놀 함량(382.54 mg․g^-1 DW)이 총 안토시아닌 함량(21.18 mg․g^-1 DW로)보다 약 18배 많은 것을 확인 할 수 있었다.

우리나라에서 Rhdododendron 속 꽃의 이용이나 성분에 관한 연구는 Hong et al. (2003)이 산철쭉나무(R. yedoense var. poukhanense)의 꽃으부터 graynatoxin Ⅰ, Ⅲ, Ⅳ 및 2α, 3β-dihydroxy-12-ene ursolic acid 등을 분리, 보고한 것이 있다. 철쭉나무, 산철쭉나무의 잎 등은 고혈압 치료의 목적으로 사용되었다고 알려져 있다(Kim et al., 2006). 그러나 철쭉꽃에는 독성이 있으며 아직까지 철쭉꽃의 독성 성분에 관한 연구는 이루어진 바가 없다(Hong et al., 2003). 철쭉꽃의 독성 성분을 제거하는 연구가 추가적으로 필요하며 이를 이용해 철쭉꽃을 기능성 성분의 소재로서 이용가능성을 높일 수 있을 것으로 사료된다. 본 연구를 통해서 Rhododendron 속 꽃의 안토시아닌 및 플라보놀 성분 파악과 다양한 꽃 색에 관한 연구에 큰 도움이 될 것으로 판단된다.