Introduction
인삼(Panax ginseng Meyer, Araliaceae)의 뿌리는 항 당뇨병, 항 염증 및 항 알레르기 효과를 나타내기 때문에 한국, 중국 및 기타 국가에서 약물로 오랫동안 사용되어 왔다(Kitagawa, 1987; Attele et al., 1999). 또한 다양한 약리학적 활성 기능이 있는 인삼의 주요 성분은 사포닌(Cheng et al., 2006)은 40 종 이상의 ginsenosides로 구성되어 있다. 다양한 세균에 의한 ginsenosides의 ginsenoside Rg3에 대한 가수분해는 다양한 생리활성 효과를 증대시킬 수 있으며 주요 ginsenosides (Rb1과 Re)를 작은 ginsenosides (Rd, F2, 화합물-K와 Rh2)로 효율적으로 전환시킬 수 있는 미생물이 발견되었다(Chi and Ji, 2005).
Ginsenoside Rd는 인삼 뿌리에서 80% 이상의 성분인 ginsenoside Rb1, Rb2, Rc의 주요 가수분해 생성물이다(Kim et al., 1987; Son et al., 2008). 또한 ginsenoside Rd는 생물학적 활성이 높은 ginsenoside Rg3, Rh2, F2 및 Compund-K의 주요 전구물질이다(Chi and Ji, 2005; Cheng et al., 2008). Ginsenoside 중 미량의 ginsenoside Rd는 면역억제 활성(Wang et al., 2012), 항 염증 활성(Yang et al., 2012), 면역보조제 활성(Han and Rhew, 2013; Kim, 2013), 신경줄기세포의 증식 촉진 효과(Lin et al., 2012; Palaniyandi et al., 2015)에 대한 연구가 진행되었다. 온화한 조건에서의 산 가수 분해(Han et al., 1982), 효소 전환(Ko et al., 2003) 및 미생물 전환(Bae et al., 2002; Senthil et al., 2009)과 같은 ginsenosides를 생산하기 위해 다양한 형질전환 방법이 사용되어왔다. 이 방법들 중에서 효소전환은 특정 ginsenosides 생산에 가장 바람직한 방법이다(Kim et al., 2005).
Lactobacillus plantarum CRNB22 (Renchinkhand et al., 2015), Enterococcus faecalis CRNB-A3 (Renchinkhand et al., 2016), Paecilomyces sp.와 같은 β-glucosidase 를 생산하는 미생물을 이용하는 미생물 생물 전환 방법(Yan et al., 2008) 및 Microbacterium sp. (Cheng et al., 2008)는 ginsenisides를 생산하는데 사용되었다.
대식세포(macrophage)는 탐식세포로 체내 이물질에 대하여 초기 면역 반응을 담당하고 유도한다. 활성화된 대식세포는 표적세포 살해뿐만 아니라, 세포 독성능이 있는 Iinterleukin (IL)-6, tumor necrosis factor (TNF)-α, nitric oxide (NO) 같은 물질을 분비한다. 본 연구는 인삼 Paenibacillus MBT213을 접종하여 발효시킨 인삼발효액을 마우스 대식세포인 Raw 264.7에 처리하여 대식세포가 생산하는 cytokine의 발현 조절에 미치는 영향을 조사하기 위해 수행하였다.
Materals and Methods
Fermented ginseng
충남 금산에서 생산한 6년근 인삼을 Renchinkhand et al. (2017)의 방법으로 발효시켜 시료로 사용하였다.
Cell culture
수컷 BALB/c mouse macrophage cell line인 Raw 264.7 세포는 KRIBB (Daejeon, Korea)에서 분양 받았고 Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)에 10% fetal bovine serum (FBS; Gibco, Rockville, MD, USA), 과 1% (100 U/mg) penicillin/streptomycin (Sigma, St. Louis, MO, USA)을 첨가하고, 37℃, 5% CO2와 대기 습도가 유지되는 배양조건에서 배양하였다. 24-well (Sigma, St. Louis, MO, USA)에 4 × 105 CFU/mL 조정하여 24 시간 배양 후 인삼 발효액을 50 μg/mL 처리하였다.
Cell viability by water soluble tetrazolium (WST) assay
인삼 발효액이 Raw 264.7 세포에 미치는 세포독성 여부 측정은 96 well에 1 × 104 cells/well이 되도록 분주하고 24시간 배양 후 0, 3, 7, 14일 동안 발효시킨 인삼 발효액 50 μg/well를 처리하여 37℃, 5% CO2에서 6, 12, 24시간 배양 후 WST assay를 실시하였다. EZ-Cytox WST assay reagent (Daeil Lab Service Co., Ltd., Seoul, Korea)을 10 µL 첨가하고 2시간 후에 ELISA reader를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.
Production of NO
Nitric oxide의 생산량은 세포배양 상층액 50 μL와 동량의 griess reagent (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA )를 혼합하여 15분 반응 후 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.
Expression of Cytokine
인삼 발효액을 처리한 Raw 264.7 세포의 염증관련 cytokine인 IL-6, TNF-α의 mRNA의 발현은 PCR (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)로 수행하였다. Positive control은 Lipopolysaccharide (LPS) (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA) 1 μg/mL을 처리하였다. 배양한 세포를 회수하여 1 mL TRizol (Invitrogen Corporator, Carlsbad, CA, USA)을 넣고 10분 동안 방치한 후 chloroform을 넣고 10초 동안 격렬하게 흔든 다음 15,000 × g에서 15분 동안 원심분리하고 상층액을 취하여 동량의 isopropanol을 혼합하여 흔들어주었다. 15,000 × g 에서 10분 동안 원심분리하여 상층액을 제거하고 pellet은 diethyl pyrocarbonate (DEPC)-DW 60 μL에 녹여 RT-PCR에 사용하였다. RT-PCR kits (Madison, WI, USA)에 Oligo dT, dNTP mix, Ribonuclease inhibitor, M-MLV Reverse Transcriptase, M-MLV RT 5X buffer를 사용하여 45℃에서 30분, 94℃에서 5분 동안 반응시킨 후 94℃에서 30초 동안 denaturation 시키고, 55 - 62℃에서 30초 동안 annealing시킨 다음, 72℃에서 1분 동안 24 - 27 cycle 반복한 뒤, 마지막 extension은 72℃에서 5분 동안 PCR (Applied Biosystems, Foster, CA, USA) 을 수행하였다. PCR 산물은 2% agarose gel에 주입하고 100 V 조건에서 15분 동안 전기영동을 수행하였다. RT-PCR에 사용한 primer는
glutaldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH):
Forward: ACAGTCTTCTGGGTGGCAGT,
Reverse: CCATCACCATCTTCCAGGAG;
IL-6:
Forward: TGGAGTCACAGAAGGAGTGGCTAAG,
Reverse: TCTGACCACAGTGAGGAATGTCCAC;
TNF-α:
Forward: ATGAGCACAGAAAGCATGATCCGC,
Reverse: CCAAAGTAGACCTGCCCGGACTC 이다.
Quantity of cytokine
Raw 264.7 세포를 24-well (Sigma, St. Louis, MO, USA)에 4 × 105/mL로 조정 후 LPS (Sigma Aldrich) 1 μg/mL을 처리하고, 대조군과 인삼 발효 추출물 3, 7, 14일로 나누어 배양액을 50 μg/mL을 Raw 264.7에 처리하고, 6, 12, 24시간 배양 후 상층액을 모아 enzyme-linked immune-sorbent assay (ELISA) kit (BD Bioscience, USA)를 이용하여 TNF-α와 IL-6를 측정하였다.
Statistics
통계분석은 SAS version 9.4 (SAS Institute Inc., USA)을 이용하였고, 처리 평균간의 유의성은 Duncan's multiple range test를 이용하여 p < 0.05 수준에서 유의적 차이를 검정하였다.
Results and Discussion
Cell viability
Human mast cell (HMC)-1 세포주에 발효시킨 인삼발효액을 처리하여 WST assay를 통하여 세포 독성을 조사한 결과는 Fig. 1에 나타난 바와 같다. WST는 수용성의 tetrazolium salt가 살아있는 세포와 반응하여 fomazan을 생성하여 세포내의 모든 dehydrogenase와 반응하여 세포의 상태를 명확하게 파악하는 것이 가능하다. Fig. 1에 나타난 바와 같이 인삼발효액은 Raw 264.7 세포의 성장을 저해하는 독성이 없는 것으로 나타났다. 대조구을 100% 기준으로 3, 7, 14일 동안 배양한 인삼발효액은 대조구보다 높은 생존율을 보임으로서 인삼발효액이 세포성장에 독성효과가 전혀 나타내지 않았다.
Fig. 1. Effect of fermented ginseng by Penibacillus MBT213 on the cell viability water soluble tetrazolium (WST)-1 in Raw 264.7 cells for 6, 12, 24 h at 37℃. Fermented ginseng by Penibacillus MBT213 were treated to Raw 264.7 cells for 3, 7, 14 days. Each bar represents the average ± SE of three independent experiments. Lipopolysaccharide (LPS) (1 μg/mL) treatment alone served as a positive control. Level of significance was identified statistically compare with control using Duncan's multiple range test (*p < 0.05)
Production of NO
마우스 대식세포에서 염증성 자극이나 면역학적 자극에 의하여 합성되고 다량의 NO를 생성한다 (Stuehr and Marletta, 1985). NO는 침입한 미생물이나 종양 세포에 대한 독성을 갖는 방어물질로서 작용하고 (Hierholzer et al., 1998), 때로는 숙주에 치명적인 결과를 초래할 수 있는 것으로 보고되고 있다 (McDaniel et al., 1996). 인삼을 3, 7, 14일 동안 발효한 인삼발효액을 6, 12, 24 시간 동안 Raw 264.7 세포에 처리하여 NO의 생산량을 측정한 결과는 Fig. 2와 같다. Raw 264.7 세포에 6 시간 배양에서는 positive control, negative control, 3, 7, 14일 모두 9 - 13 μM이 생산됨에 따라 시료 간의 차이가 없었다. 12 시간 배양에서는 6시간 배양 보다 positive control과 negative control이 13 - 18 μM로 약간 높게 생산되었고, 3, 7, 14일 배양액에서는 6시간 배양과 동일한 9 - 13 μM이 생산됨에 따라 6시간과 12시간 배양에는 시료 간의 차이가 거의 없었다. 반면 24시간 배양인 경우는 positive control은 35 μM인데 비해, 3일, 7일, 14일 배양액의 NO 생산량은 각각 9, 20, 22.5 μM로 나타나 positive control과 비교하면 각각 74, 43, 36%로 현저하게 감소하였다. 이러한 결과는 인삼발효액이 NO의 생산을 억제하여 염증 반응에 관련된 물질을 조절하는 효과가 있는 것으로 사료된다. 이는 Raw 264.7 세포에 현삼 메탄올 추출물을 처리하여 18시간과 24시간 동안 배양 후 NO의 생산량을 측정한 결과 유의성 있게 억제되었다는 Byun et al., (2005)의 보고와 동일하였다. 이와 같이 인삼 발효 시간이 길어짐에 따라 NO 생산은 증가하였는데 이는 ginsenoside Rb1이 Rd로 전환되는 양이 증가 (Renchinkhand et al., 2017)한 영향과 또 다른 대사산물이 Raw 264.2 cell에서 NO의 생산에 영향을 미치는 것으로 사료된다.
Fig. 2. The production quantity of nitric oxide (NO) in Raw 264.7 cells by fermented ginseng by Penibacillus MBT213 for 6, 12, 24 h at 37℃ of fermented ginseng by Penibacillus MBT 213 were treated to Raw 264.7 cells for 3, 7, 14 days. Each bar represents the average ± SD of three independent experiments. Lipopolysaccharide (LPS) (1 μg/mL) treatment alone served as a positive control. Level of significance was identified statistically compare with control using Duncan's multiple range test (*p < 0.05)
Cytokine expression and production
IL-6는 B 세포가 항체 생산을 위해 plasma 세포로 분화되는 마지막 단계를 활성화시켜 항체 분비를 촉진한다. 또한 염증반응에서 IL-6는 항상 증가한다 (Delgado et al., 2003). Raw 264.7 세포에 Penibacillus MBT213으로 배양한 인삼발효액을 처리한 IL-6와 TNF-α의 발현은 Fig. 3에 나타난 바와 같다. IL-6는 3, 7, 14일 동안 발효시킨 인삼발효액을 6, 12, 24시간 처리한 결과 positive control은 처리 시간에 비례하여 강하게 발현을 하였지만 negative control과 3, 7, 14일 배양액에서 발현되지 않았다. 이는 인삼발효액이 Raw 264.7 세포에 작용하여 IL-6의 발현을 강하게 억제하는 것으로 사료된다.
TNF-α는 대식세포와 비만세포에서 분비되는데 암세포에 세포독성을 나타내며 만성염증반응과 관련이 있다 (Delgado et al., 2003). 3, 7, 14일 동안 발효시킨 인삼발효액을 6, 12, 24시간 처리한 positive control은 처리 시간에 비례하여 TNF-α가 발현하였는데 24시간 처리에서 가장 강하게 발현한 반면, 3, 7, 14일 동안 발효시킨 인삼발효액을 6시간 처리시에는 아주 미약하게 발현되었고, 12시간 처리시에는 약하게, 24시간 처리시에는 강하게 발현되었다. 이는 인삼발효액이 Raw 264.7 세포에 처리했을 때 TNF-α의 발현은 처리 시간에 따라 매우 민감하게 나타났다. 이와 같은 결과는 인삼발효액이 6시간과 12시간보다 24시간 처리시에 Raw 264.7 세포에 더 크게 영향을 미치기 때문으로 사료된다. Raw 264.7 세포에서 IL-6와 TNF의 생산량을 측정한 결과는 Fig. 4와 같다. Fig. 3의 발현과 동일하게 IL-6의 생산은 3, 7, 14일 동안 발효시킨 인삼발효액을 6, 12, 24시간 처리한 결과 positive control은 처리 시간에 비례하여 많이 생산하였지만 negative control과 3, 7, 14일 배양액에서는 아주 적은 량을 생산하였다.
Fig. 3. The expression of tumor necrosis factor (TNF)-α and Iinterleukin (IL)-6 in Raw 264.7 cells by fermented ginseng by Penibacillus MBT213 for 6, 12, 24 h at 37℃. Fermented ginseng by Penibacillus MBT213 were treated to Raw 264.7 cells for 3, 7, 14 days. GAPDH, glutaldehyde-3-phosphate dehydrogenase; LPS, Lipopolysaccharide
Fig. 4. The production quantity of tumor necrosis factor (TNF)-α and Iinterleukin (IL)-6 in Raw 264.7 cells by fermented ginseng by Penibacillus MBT213 for 6, 12, 24 h at 37℃. Fermented ginseng by Penibacillus MBT 213 were treated to Raw 264.7 cells for 3, 7, 14 days. Each bar represents the average ± SD of three independent experiments. Lipopolysaccharide (LPS) (1 μg/mL) treatment alone served as a positive control. Level of significance was identified statistically compare with control using Duncan's multiple range test (*p < 0.05)
Raw 264.7 세포에 3, 7, 14일 동안 발효한 인삼발효액을 6, 12, 24시간 처리한 positive control은 처리 시간에 비례하여 TNF-α가 생산되었는데, 24시간 처리에서 가장 많이 생산된 반면, 3, 7, 14일 동안 발효시킨 인삼발효액을 6시간 처리시에는 40,000 pg/mL 정도 생산되었고, 12시간 처리시에는 7일과 14일 인삼발효액에서 각각 85,000 pg/mL과 65,000 pg/mL 정도 생산되었고, 24시간 처리시에는 7일과 14일 인삼발효액에서 각각 160,000 pg/mL과 180,000 pg/mL 정도 생산되었다. 이러한 결과는 인삼발효액을 Raw 264.7 세포에 처리했을 때 TNF-α의 억제는 처리 시간이 짧을 때 효과가 있는 것으로 사료된다. IL-6의 발현과 생산은 인삼 발효 시간에 관계없이 강하게 억제하는 것으로 조사되었는데, 이는 ginsenoside Rb1이 Rd로 전환된 것과 또 다른 대사산물의 양에 상관없이 IL-6의 발현과 생산에 영향을 미치는 것으로 사료된다. 한편, 인삼 발효 시간이 길어짐에 따라 TNF-α의 발현과 생산은 증가하는 것으로 조사되었는데 이는 ginsenoside Rb1이 Rd로 전환되는 양이 증가 (Renchinkhand et al., 2017)한 영향과 또 다른 대사산물이 Raw 264.2 cell에서 TNF-α의 발현과 생산에 영향을 미치는 것으로 사료된다.
한편, 유익한 미생물을 이용한 발효 인삼의 ginsenoside 전환에 대해Renchinkhand et al., (2016)은 Enterococcus faecalis CRNB-A3를 접종하여 발효시킨 인삼의 ginsenoside의 분포는 Rb1이 Rg3 (epimer S/R)와 Rg5로 전환되었음을 보고하였고, Microbacterium sp. GS514로 발효시킨 ginsenoside Rb1은 Rg3 로 전환되었다고 Cheng et al. (2008)이 보고하였다. 또한 Chi and Ji (2005)는 ginsenoside Rb1을 Bifidobacterium sp. Int 57과 Bifidoacterium sp. SJ32로 발효시키면 compound-K (Rb1 → Rd → F2 → compound-K) 로 전환되었음 보고하였다.
Conclusion
마우스의 대식세포인 Raw 264.7에 Paenibacillus MBT213에 의해 발효된 인삼발효액을 처리하여 NO, IL-6, TNF-α의 변화를 조사하였다. NO 생산량은 positive control과 비교하면 각각 74, 43, 36%로 현저하게 감소하였다. IL-6는 미량 생산하였고, TNF-α의 생산 억제효과는 6시간과 12시간으로 처리시간이 짧을 때였다. 따라서 Paenibacillus MBT213에 의해 발효된 인삼발효액은 항염증기능이 있어 기능성 식품과 의약품 소제로 산업에 적용가능 할 것이라 사료된다.
