Introduction
무당벌레(Harmonia axyridis)는 딱정벌레목(Coleoptera) 무당벌레과(Coccinellidae)에 속하는 곤충으로 중앙아시아, 동아시아의 토착종이며(Dobzhansky, 1933; Majerus, 1994; Coderre et al., 1995; Koch, 2003), 여러 종류의 진딧물, 깍지벌레, 응애, 총채벌레 등과 같이 연조직으로 되어있는 해충을 포식하는 주요한 천적으로 알려져 있다(Choi and Kim, 1985; Gordon, 1985; Ferran et al., 1986; Ferran et al., 1996; Hodek and Honek, 1996; Seo and Youn, 2000, 2001; Koch, 2003). 무당벌레는 전세계적으로 약 490속, 4,000여종이 보고되어 있으며(Singh, 1977), 우리나라에서는 38속 74종이 보고되어 있고(ESK and KSAE, 1994), 북아메리카에서 400여 종(Belicek, 1976), 유럽에는 110여종이 분포하고 있을 뿐만 아니라 남아메리카, 아프리카 등지에 이르기까지 전 세계적으로 분포하고 있다(Iperti, 1986; Chapin and Brou, 1991; Day et al., 1994; Tedders and Schaefer, 1994; Coderre et al., 1995; Kidd et al., 1995; Lamana and Miller, 1998; Koch et al., 2006; Brown et al., 2007). 또한 무당벌레는 성충과 유충이 모두 작물과 정원 식물에서 흡즙을 하여 가해를 하는 진딧물에 대한 포식력이 뛰어나 생물적 방제인자로서 많이 사용하고 있는 종으로 경제적으로 높은 가치를 가지고 있다(Markkula and Tittanen, 1980; Kauffman and Schwalbe, 1991; Freier and Triltsch, 1995; Seo and Youn, 2000, 2001, 2002; Koch, 2003). 그러나 미국에서 천적으로써 순기능 말고도 농작물을 가해하거나 다른 무당벌레 종의 개체군을 감소시키는 침투외래종으로 보고되기도 하였다(Koch et al., 2004; Roy and Wajnberg, 2008; Kenis et al., 2007; Koch and Galvan, 2008). 한편, 무당벌레의 또 다른 특징은 초시에 나타나는 다양한 색상과 무늬로 이에 관하여 많은 사람들이 연구를 해오고 있다. 곤충의 날개에 나타나는 다양한 패턴형성의 메커니즘은 세포생물학적, 유전학적, 생화학적인 측면에서 뿐만 아니라 발생학적인 측면에서도 아주 흥미로운 문제로 다뤄지고 있었으며(Oshima et al., 1956), 무당벌레의 초시무늬의 색상패턴은 과거에 서로 다른 종 혹은 다른 속의 곤충으로 분류되었을 정도로 다형성을 가진다고 보고되었다(Tan, 1946). 또한 Soares et al. (2001)는 100여종 이상의 다른 초시무늬 패턴을 보고하였으며, Tan and Li (1932) 또한 지역별로 다른 200여종 이상의 초시무늬 패턴을 보고한 바 있다. 국내에서는 초시색상 패턴의 유전 및 관련 유전자 탐색을 위하여 곤충의 색소침적에 관여하는 prophenlooxidease (PPO) 유전자가 무당벌레 내에 존재하는지 연구한 바가 있으며, amplified fragment length polymorphism (AFLP)를 통해 초시색상패턴의 변이를 분석하여 초시색상과 관련이 있는 AFLP 분자지표 10개 중 5개를 sequence characterized amplified region (SCAR) 분자지표로 성공적으로 전환한 연구가 보고되었다(Kim et al., 2012; Park et al., 2016). 또한 Seo et al. (2007)이 무당벌레 초시무늬의 표현형 변이와 유전적인 상관에 관한 연구에서 유전적인 요인 뿐만 아니라 환경적인 요인이 복합적으로 작용하여 초시무늬를 결정한다고 보고한 바 있으며, 유충시기의 먹이 양, 번데기 기간 동안의 온도와 습도, 계절의 변화 등이 초시무늬 발현 비율에 영향을 미칠 수 있다고 보고되었다(Komai, 1956; Osawa and Nishida, 1992; Grill and Moore, 1998). 이 뿐만 아니라 평균기온과 일조량이 높고 길수록 멜라닌계통의 색상패턴 발현율이 높게 나타난다고 보고된 바 있다(Kang et al., 2009). 그러나 무당벌레 초시무늬 패턴형성에 어떠한 요인에 의해 변이가 일어나는 정확하게 밝혀진 연구가 없다.
RNAi (RNA interference)는 dsRNA (double-stranded RNA)에 의해 배열 특이적으로 mRNA가 분해되는 유전자 발현 억제 현상으로, 세포 내로 dsRNA가 이입되면 RNase III군에 속하는 Dicer에 의해 21 - 25 nt의 siRNA (small interfering RNA)로 절단되고, 이렇게 생긴 siRNA가 RISC (RNA induced silencing complex)와 결합한 후에 상보적인 배열을 갖는 mRNA에 결합하여 선택적으로 분해함으로써 mRNA의 발현을 억제시키는 과정을 거친다(Fire et al., 1998; Sijen et al., 2001; Bellés, 2010). 이러한 RNAi 기법은 예쁜꼬마선충(Caenorhabditis elegans)에서 처음으로 확인한 이후로(Fire et al., 1998), 유전자 기능 분석을 위해 폭넓게 이용하고 있으며(Fjose et al., 2001), 딱정벌레목(거짓쌀도둑 거저리, 무당벌레, 좀남색잎벌레, 운남점얼룩하늘소), 바퀴벌레목(독일바퀴, 이질바퀴), 파리목(노랑초파리, 이집트숲모기, 쉬파리, 구리금파리, 호리꽃등에), 노린재목(담배가루이, 침노린재, 긴노린재), 벌목(양봉꿀벌, 파리금좀벌), 나비목(담배거세미나방, 파방나방, 박각시나방, 화랑곡나방), 메뚜기목(풀무치, 쌍별귀뚜라미), 흰개미목, 풀잠자리목 등 많은 곤충에서 연구되었고(Bellés, 2010; Kim et al., 2015; Ko and Youn, 2015), 농업 환경에서 해충을 방제하기 위해 잠재적으로 사용될 수 있는 새로운 대안으로 제안되고 있다(Baum et al., 2007; Mao et al., 2007; Huvenne and Smagghe, 2010). 곤충에서 유전자 기능 분석에 대한 RNAi의 첫 성공적인 적용은 초파리 배아에 dsRNA를 주입한 연구이며(Kennerdell and Carthew, 1998), 그 이후에 다핵배반으로 dsRNA를 주입하는 embryonic RNAi가 보고되었다(Fjose et al., 2001). 그러나 embryonic RNAi는 성충발달을 분석하기에 적합하지 않아 Tomoyasu and Denell (2004)은 곤충 체강으로 dsRNA를 주입하여 성충발달 분석에 용이한 larval RNAi를 보고하였다. dsRNA를 곤충 체내로 전달하는 방법은 먹이에 dsRNA를 처리하여 구강을 통해 전달하는 섭식 방법(feeding), 체내로 주사기로 주입 하는 방법(injection), dsRNA solution에 흠뻑 적셔 흡수시키는 방법(soaking)이 있는데(Yu et al., 2013), 이러한 전달방법은 실제 포장에서 이용하기에 시간과 비용면에서 경제적이지 않아 더욱 효과적인 dsRNA 전달 방법이 필요하다.
본 연구는 무당벌레의 초시무늬에 어떠한 유전자가 관여하는지, 또 아직 밝혀지지 않은 무당벌레의 유전자를 찾아내기 위해서 선행 연구로 완성한 무당벌레의 cDNA library를 gene screening 하였으며, in vitro> transcription으로 유전자를 선발하고, 선발된 유전자를 RNA interference 기법으로 무당벌레에 적용하여 표현형 변이를 관찰하였다.
Materials and Methods
공시충 채집 및 사육
무당벌레(Harmonia axyridis)는 2015년 충청남도 금산군에서 채집한 월동개체군과 2016년 대전광역시 유성구 궁동에서 채집한 야외개체군을 plastic insect breeding dish (직경 10 × 4 cm)에 목화진딧물, 복숭아혹진딧물을 진딧물의 기주 식물과 함께 제공하여 누대사육하였다. 새로 태어난 세대의 4령 유충을 실험에 사용하였고, 모든 사육은 25 ± 1℃, 16L : 8D, 상대습도 50 - 60%의 조건에서 개체 사육하였다.
무당벌레 cDNA library 유전자 크리닝
E. coli DH5α competent cell을 이용한 유전자 스크리닝
· E. coli 형질전환
LITMUS 28i vector에 클로닝한 무당벌레 cDNA library를 DH5α E. coli competent cell에 형질전환 켰다. 살짝 녹여진 DH5α competent cell에 LITMUS 28i vector에 클로닝한 DNA plasmid를 1 μL 넣고, 가볍게 두드려 잘 섞이게 한다. 얼음에 5분동안 넣어놓은 후에 45초 간 42℃에서 열 충격을 가했다. 열 충격 후, 2분간 얼음에 넣은 다음 LB broth 1 μL를 넣고 37℃ 진탕배양기에서 1시간 동안 배양하였다. 1시간 후 ampicillin을 넣은 LB Plate에 300 μL를 도말 하고 37℃에서 하룻밤 동안 배양하였다.
· 콜로니 및 Plasmid DNA 분리
37℃에 하룻밤 동안 배양시켰던 ampicillin 배지를 꺼내어 단일 콜로니를 pipette tip을 이용하여 LB broth 3 μL에 분리하였다. 37℃ 진탕배양기에서 180 rpm으로 하룻밤 동안 DH5α E.coli cell을 배양하였다. LB broth에 하루 동안 배양시킨 cell을 Alkaline Lysis법을 이용하여 DNA를 추출하였다(Birnboim and Doly, 1979).
· 제한효소 처리 – EcoRI, HindIII
in vitro> transcription을 하기 위해 LITMUS 28i Vector (NEB, Korea)에 무당벌레 cDNA library를 클로닝한 것을 EcoRI과 HindIII로 처리하여 삽입유전자의 크기를 확인하였다. Plasmid DNA 분리로 얻은 plasmid DNA 7 μL, EcoRI (NEB, Korea) 0.5 μL, HindIII (NEB, Korea) 0.5 μL, 2.1 buffer 1 μL, 증류수 1 μL (총 10 μL)를 37℃에서 6시간동안 반응시켰다.
E. coli DH10B competent cell을 이용한 유전자 스크리닝
· E. coli 전기충격 형질전환
LITMUS 28i vector에 클로닝한 cDNA library는 Electroporator (Bio-Rad, USA)를 이용하여 ElectroMAXTM DH10B Cells (Invitrogen, USA)에 형질전환 시켰다. Electroporator는 voltage 1.8 kV, resistance 200 Ω, capacity 25 uF로 설정하였다. LITMUS 28i Vector (NEB, Korea)에 클로닝한 cDNA library 2 μL를 넣어 총 100 μL를 냉각된 E. coli pulser® cuvette (BIO-RAD, USA)에 전기충격을 주고 나서 SOC medium 900 μL를 넣어 피펫팅 하였다. 피펫팅을 하고 나서 새로운 1.5 μL Eppendorf tube (Eppendorf, Germany)에 옮겨 1시간 동안 37℃ 진탕배양기에서 배양하였다. 1시간 후에 ampicillin이 들어간 LB plate에 10-1부터 10-4까지 희석하여 100 μL씩 도말하고 37℃에 하룻밤 동안 배양 후, 콜로니의 수를 세어 적정농도를 계산하고 무당벌레 유전자 스크리닝하는데 사용하였다. 전기천공법 후에 사용하고 남은 cDNA library는 300 μL씩 aliquot하여 70% glycerol 200 μL를 넣은 뒤 부드럽게 인버트 5번하여 - 80℃에 library stock으로 보관하였다.
· 콜로니 및 Plasmid DNA 분리
37℃에 하룻밤 동안 배양시켰던 ampicillin 배지를 꺼내어 단일 콜로니를 pipette tip을 이용하여 LB broth 3 μL에 분리하였다. 37℃ 진탕배양기에서 180 rpm으로 하룻밤 동안 DH10B E.coli cell을 배양하였다. LB broth에 하루 동안 배양시킨 cell을 Alkaline Lysis법을 이용하여 DNA를 추출하였다(Birnboim and Doly, 1979).
· 제한효소 처리 – EcoRI, HindIII
in vitro> transcription을 하기 위해 LITMUS 28i Vector(NEB, Korea)에 무당벌레 cDNA library를 콜로닝한 것을 EcoRI과 HindIII로 처리하여 삽입유전자 크기를 확인하였다. Plasmid DNA 분리로 얻은 plasmid DNA 7 μL, EcoRI (NEB, Korea) 0.5 μL , HindIII (NEB, Korea) 0.5 μL, 2.1 buffer 1 μL, 증류수 1 μL (총 10 μL)를 37℃에서 6시간동안 반응시켰다.
Double-stranded RNA 합성
Enzyme cutting – HpaI
무당벌레 cDNA library에서 삽입유전자가 확인된 임의의 유전자들을 double-stranded RNA로 합성하기 위해 LITMUS 28i vector에 클로닝되어 있는 plasmid 주형을 제한효소 HpaI으로 처리하여 선형()으로 만들었다. 선형의 plasmid DNA 7 μL, Hpa I (NEB, Korea) 1 μL, Cutsmart Buffer 1 μL, 증류수 1 μL (총 10 μL)를 37℃에서 하룻밤 동안 반응시켰다.
Double-stranded RNA 합성
선형으로 만든 DNA 주형과 T7 RiboMaxTM Express RNAi system kit (Promega, USA)를 이용하여 14개의 double-stranded RNA를 합성하였다. RiboMaxTM Express T7 2X Buffer 10 μL, 선형 DNA template 2 μL, Nuclease-Free Water 6 μL, Enzyme Mix, T7 Express 2 μL (총 20 μL)를 37℃에서 2시간동안 반응 시키고 dsRNA를 annealing 하기 위해 70℃에서 10분동안 반응시킨 뒤 상온에서 20분동안 반응시켰다. dsRNA 이외에 남아있는 DNA template와 ssRNA를 제거 하기 위해서 200배 희석시킨 RNase 1 μL, DNase 1 μL를 넣고 37℃에서 30분동안 반응시켰다. 반응시킨 dsRNA는 에탄올 다운을 하여 증류수 30 μL에 용리시켰다.
Double-stranded RNA 주입
탈피한 후 0 - 2일이 된 무당벌레 4령 유충에 in vitro> transcription 과정을 통하여 합성한 dsRNA를 주입하였다. 유충 체내로 직접 전달되게 하도록 dsRNA를 주입하기 3시간 전부터 굶겼으며, 표현형 변화를 효과적으로 비교하기 위해 대조구로서 무처리구, 증류수 주입을 하였다. dsRNA는 syringe (Hamilton, USA)를 이용하여 한 처리구 당 25마리 내외의 무당벌레 4령 유충에 1 μg/μL를 복부 제 1마디와 제 2마디 사이에 Niimi et al. (2005)의 방법을 참고하여 주입하였다. 주입한 후에 성충이 될 때까지 목화진딧물과 복숭아혹진딧물을 먹이로 제공하였다(Fig. 1).
Results
cDNA library 유전자 스크리닝
E.coli DH5α competent cell을 이용한 유전자 스크리닝
· 삽입유전자 크기 확인
열 충격을 통해 얻어진 cDNA library에서 유전자를 선발하고 크기를 확인하기 위해서 10-1로 희석하여 도말한 ampicillin 배지에서 무작위로 취하여 콜로니 prep을 하였다. Ampicillin 배지에 뜬 콜로니는 총 95개로, 그 중 72개를 콜로니 prep하였으며, 중복되는 유전자를 제외하고 18개의 삽입유전자가 확인되었고, 그 유전자의 크기는 150 - 500 bp로 다양한 크기를 확인할 수 있었다(Fig. 2).
Fig. 2. Insert DNA of cDNA library was constructed from Harmonia axyridis on the electrophoresis. Plasmid from 18 randomly selected colonies were analyzed on agarose gel for insert size. Insert size was confirmed with the size of 150 - 500 bp. M, 1 kb plus ladder marker; Lane 1 - 18, Harmonia axyridis cDNA library random gene insert.
· 염기서열분석 및 NCBI blast
LITMUS 28i vector에 클로닝 되어있던 무당벌레 cDNA library를 스크리닝한 24개의 유전자의 염기서열을 알아보기 위해 plasmid DNA를 분리하였고, 제한효소 EcoRI과 HindIII 처리를 통하여 삽입유전자를 확인한 후, 염기서열분석을 의뢰하고(Macrogen, Korea), NCBI blast를 통해 중복되는 유전자가 있는지 확인하였다(Table 1). 그 결과 11개의 유전자는 곤충 유전자와 상동성을 보이는 유전자로 확인되었고, 7개는 곤충이 아닌 다른 종의 유전자와 상동성을 보였으며, 무당벌레 유전자는 1개가 확인되었다(Table 4). 무당벌레 유전자가 아닌 곤충 유전자 10개 중 6개가 딱정벌레목으로 무당벌레와 유사한 종의 유전자가 확인되었다.
|
Table 1. NCBI blast search data of Harmonia axyridis cDNA library gene screening using E. coli DH5α competent cell for confirm redundancy. 
|
|
Table 2. Harmonia axyridis cDNA library titration after transforming in E. coli DH10B competent cell. The cDNA library titration was determined by counting colonies. 
|
E.coli DH10B competent cell을 이용한 유전자 스크리닝
· cDNA library 적정농도
Electroporator를 이용하여 ElectroMAXTM DH10B Cells (Invitrogen, USA)에 무당벌레 cDNA library를 transformation시킨 후 37℃ 진탕배양기에서 1시간동안 보관하였다. 1시간 뒤 cDNA library를 10-1에서 10-4까지 희석하여 ampicillin배지에 도말한 후 37℃에 하룻밤 동안 배양한 뒤 다음날 꺼낸 다음 콜로니를 세어 cDNA library 적정농도를 측정하였다. 그 결과, 10-4희석액을 도말한 배지에서 7개의 콜로니를 확인하였고, 10-3희석액을 도말한 배지에서는 64개, 10-2희석액에서는 373개, 10-1 희석액에서는 셀 수 없을 정도로 많은 콜로니를 확인하였다. 무당벌레 cDNA library cell stock으로 얻어진 적정농도는 5.71 × 104이었다(Table 2).
· 삽입유전자 크기 확인
전기충격을 통해 얻어진 cDNA library에서 유전자를 선발하고 크기를 확인하기 위해서 10-1로 희석하여 도말한 ampicillin 배지에서 무작위로 취하여 콜로니 prep을 하였다. 그 중 24개의 콜로니에서 삽입유전자가 확인되어 유전자를 선발하였고, 그 유전자의 크기는 130 - 500 bp로 다양한 크기를 확인할 수 있었다(Fig. 3).
Fig. 3. Insert DNA of plasmid was selected from colonies of E. coli transformed with Harmonia axyridis cDNA library on the electrophoresis. Plasmid from 24 randomly selected colonies were analyzed on agarose gel for insert size. Insert size was confirmed with the size of 130 - 500 bp. M, 1 kb plus ladder marker; Lane 1 - 24, Harmonia axyridis cDNA library random gene insert.
· 염기서열분석 및 NCBI blast
LITMUS 28i vector에 클로닝 되어있던 무당벌레 cDNA library를 스크리닝한 18개의 유전자의 염기서열을 알기 위해 plasmid DNA 분리하였고, 제한효소 EcoRI과 HindIII 처리를 통하여 삽입유전자를 확인한 후, 염기서열분석을 의뢰하고(Macrogen, Korea), NCBI blast를 통해 중복되는 유전자가 있는지 확인하였다(Table 3). 그 결과 11개의 유전자는 곤충 유전자와 상동성을 보이는 유전자로 확인되었고, 13개는 곤충이 아닌 다른 종의 유전자가 확인되었으며, 무당벌레 유전자와 상동성을 보이는 유전자는 확인되지 않았다(Table 4). 무당벌레 유전자가 아닌 곤충 유전자 13개 중 6개가 딱정벌레목으로 무당벌레와 유사한 종의 유전자가 확인되었다.
|
Table 3. NCBI blast search data of clones selected in E. coli DH10B competent cell transformed with Harmonia axyridis cDNA library. 
|
|
Table 4. Results of sequencing analysis with a colonies using E. coli DH5α competent cell and E. coli DH10B competent cell in NCBI blast search. 
|
무당벌레 random gene을 이용한 RNAi
Double-stranded RNA 합성
· Enzyme cutting – HpaI
열 충격을 통해 선발한 유전자 18개중 5개(Hma 01 - 05)와 electroporator를 통해 선발한 유전자 24개 중 9개(Hma 06 - 14), 총 14개의 유전자(곤충 유전자9개, 곤충이 아닌 유전자 5개)를 double-stranded RNA로 합성하기 위해 LITMUS 28i vector에 클로닝 되어있는 유전자들에 HpaI을 처리하여 원형의 DNA을 선형의 DNA로 만들었다(Table 5). HpaI을 처리한 결과 약 3 - 4 kb정도에서 HpaI으로 잘린 밴드를 확인할 수 있었다(Fig. 4).
· Double-stranded RNA 합성
Fig. 4에서 확인한 선형의 DNA를 주형으로 T7 RiboMaxTM Express RNAi system kit (Promega, USA)를 이용하여 double-stranded RNA (dsHma 01 - dsHma 14)를 합성하였다. 그 결과 약 300 - 700 bp에서 합성된 dsRNA를 확인하였다(Fig. 5).
|
Table 5. List of gene information selected to synthesized and injected double-stranded RNA after H. axyridis cDNA library gene screening. 
|
· Double-stranded RNA 주입 후 표현형 변이
실내에서 개체 사육한 무당벌레가 4령이 된지 0 - 2일이 되었을 때, 유충의 복부 제 1마디와 제 2마디 사이에 syringe를 이용하여 double-stranded RNA를 1 μL씩 주입하였다. 처리구 설정은 무처리, 증류수, dsRNA 주입 3가지로 하였으며, 그 결과 초시무늬의 표현형을 관찰했을 때 dsHma 01 - dsHma 14에서 모두 대조구와 비슷한 표현형을 나타내는 것을 볼 수 있었다(Table 6). 또한 초시 무늬 외의 표현형 변이를 관찰했을 때는 dsHma 01 - dsHma 05를 주입한 개체들에선 일정한 표현형변이가 관찰되지 않았으며, 성충이 되기 전에 치사한 개체들이 많지만 주입한 다음날 죽거나 번데기가 되기 전에 죽었으며 대조구와 비슷한 양상으로 죽는 것으로 보아, 주입의 충격으로 치사한 것으로 보인다. dsHma 07, dsHma 09 - dsHma 14 주입구도 마찬가지로 일정한 표현형 변이를 관찰 할 수 없었다. 그러나 dsHma 06과 dsHma 08을 주입한 무당벌레에서 표현형변이를 보였다(Table 7).
dsHma 06 주입
dsHma 06의 유전자는 NCBI blast search 결과 Tribolium castaneum의 mRNA와 71%의 상동성을 갖는 유전자를 주형으로 합성한 것이며(Table 5), dsHma 06을 주입한 개체들이 용화한 후 죽은 것이 많아 성충이 된 후 장애가 있는지 확인하기 위해 먹이를 공급하여 직경 10 × 4 cm Plastic insect breeding dish에서 사육했으며, 그 결과 산란과정까지 볼 수 있었으나 3일이 지나면 부화되는 대조구와 달리 dsHma 06을 주입한 개체들이 낳은 알은 부화되지 않고 말라 죽었다(Fig. 6).
Fig. 6. Comparison of eggs oviposited Harmonia axyridis that were injected with dsHma 06 and distilled water A, A day old eggs that oviposited H. axyridis injected with distilled water; B, A day old eggs that oviposited H. axyridis injected with dsHma 06; C, Three days after H. axyridis injected with distilled water oviposit, Hatching; D, A week after, H. axyridis injected with dsHma 06 oviposit, not hatched and become shrivel and thick color.
dsHma 08 주입
dsHma 08의 유전자는 NCBI blast search 결과 Agrilus planipennis mRNA와 79%의 상동성을 갖는 유전자를 주형으로 합성한 것이며(Table 5), dsHma 08을 주입한 개체들 중 많은 개체들이 용화를 마치지 못한 채 죽거나, 번데기 상태에서 또는 우화하는 과정에서 죽었다(Fig. 7).
Discussion
무당벌레(Harmonia axyridis)는 포식성 천적으로써 많은 농작물에 피해를 주는 진딧물류의 방제에 사용되고 있으며 초시 무늬와 색상의 다형성이 잘 알려져 있다(Dobzhansky, 1933; Komai, 1956; Osawa and Nishida, 1992). 초시무늬에 관하여 많은 연구들이 있지만(Tan and Li, 1934; Tan, 1946; Komai, 1956; Seo et al., 2008; Michie et al., 2010; Lee et al., 2011), 아직 어떠한 유전자가 초시무늬에 관여하는지 알려지지 않았을 뿐만 아니라 무당벌레의 유전자에 대한 연구가 미비하다.
본 논문에서는 Jung (2016)에 의해 선행연구로 제작된 무당벌레 cDNA library를 이용하여 in vitro> transcription으로 어떠한 유전자가 무당벌레에 존재하는지 유전자 스크리닝을 하였고, 그 유전자가 어떠한 기능을 하는지 분석하기 위해 RNA interference를 이용하였다. RNAi를 이용한 무당벌레 유전자 연구는 Niimi et al. (2005)가 무당벌레 성충의 다리와 안테나 발달과 관련된 Distal-less와 aristaless double-stranded RNA를 주입하여 발달을 억제하였고, germ-line transformation 방법의 이용 가능성을 보기 위해 EGFP (enhanced green fluorescent protein) dsRNA를 주입하여 확인하였으며(Kuwayama et al., 2006), 무당벌레의 날개 형성에 중요한 역할을 하는 vestigial과 scalloped double-stranded RNA를 주입하여 생물적 방제인자로 사용하기 위한 날지 못하는 무당벌레를 유도했다(Ohde et al., 2009). 이와 같은 연구들을 통해 무당벌레 성충 발달을 위해서 유충에서의 RNA interference가 적합하다는 것을 알 수 있다.
본 논문에서는 LITMUS 28i vector에 클로닝한 무당벌레 cDNA library를 두 가지 E.coli competent cell에 다른 방식으로 형질전환시켜 그 효율을 비교하였으며, 그 결과 E.coli DH5α competent cell에 열 충격을 가하여 95개의 콜로니를 얻었고, transformation 효율을 높이기 위해 electroporator를 이용하여 E.coli 10B competent cell에 전기충격 형질전환을 하여 5.71 × 104의 cDNA library를 확인하였다(Table 2). 유전자 크기를 확인한 결과, 약 100 - 500 bp의 삽입유전자를 확인하였으며, 이전 연구에서 cDNA 크기가 200 bp이상, 최대 1,300 bp를 넘지 않아야 하며, 남부옥수수뿌리벌레 (Diabroticaundecim punctata howardi)에서 double-stranded RNA의 크기가 60 - 240 bp일 때 95% 이상의 높은 치사율을 보인 것과 비교 하면 합성하기에 적당한 크기의 삽입유전자를 확인한 것을 알 수 있었다(Liu and Page, 2008; Bolognesi et al., 2012). 무당벌레 유전자 스크리닝을 한 뒤, 염기서열분석 결과를 토대로 NCBI blast를 통해 중복되는 유전자를 확인하였으며(Table 1, 3), 그 결과 약 절반이 곤충 유전자와 한 개의 무당벌레 유전자와 상동성을 보이는 유전자를 확인하였다(Table 4). 곤충 유전자 중에서도 대부분이 무당벌레와 같은 딱정벌레목 곤충이었으며 이는 아직까지 무당벌레에 대한 유전자 연구가 많이 되어있지 않아서 유사한 종의 유전자들로 확인된다는 것을 보여준다. 유전자 스크리닝을 통해 선발된 유전자들을 double-stranded RNA로 합성시켜 무당벌레의 종령 유충의 복부에 주입하고 그에 따른 표현형 변이가 나타나는지 관찰하였다. 표현형 변이로 보이는 두 가지 유전자를 확인하였다. 첫 번째로 난황형성에 장애를 일으키는 변이를 보인 dsHma 06의 유전자는 거짓쌀도둑거저리(Tribolium castaneum)의 유전자로 특징지어지지 않은 유전자로 아직 밝혀진 역할은 없는 유전자였다(Table 5). dsHma 06을 주입한 개체들 중 성충까지 성장한 개체들이 교미 후 산란까지 하였는데, 대조구로서 증류수를 주입한 개체들의 알은 산란한지 3일 만에 부화는 반면 dsHma 06을 주입한 개체들이 산란한 알은 전체가 부화하지 않았다(Fig. 6). 이는 난황형성에 관련된 유전자가 knock-out되어 제대로 된 알을 산란하지 못하고 무당벌레 성충의 정상적인 생식활동을 저지하는 것으로 생각된다. 난황형성에는 유약호르몬(juvenile hormone)과 신경분비호르몬, ecdysteroid (20-hydroxyecdysone, ecdysone) 등의 복합작용으로 조절된다(Zou et al., 1988; David et al., 1998; Kozhanova, 2000; Boo, 2001). 그 중에도 특히 유약호르몬은 난모세포에 난황형성을 촉진시키고 단백질 대사를 조절하여 난 성숙에 관여한다(Hagedorn and Kunkel, 1979; Kozhanova, 2000). 독일 바퀴벌레(Blattella germanica)에서 dsBgVgR (vitellogenin receptor)을 종령 약충에 주입하고 8일 후에 절개하였을 때, 기초 난모세포로 vitellogenin의 흡수가 이루어지지 않고 혈림프 내에 vitellogenin이 남아있어 난모세포의 성숙이 이루어지지 않았고 (Ciudad et al., 2006), 꿀벌(Apis mellifera), 개참진드기(Dermacentor variabilis) 등에서도 dsVgR을 주입하여 난황형성억제 현상을 확인하였다(Amdam et al., 2003; Mitchell et al., 2007; Antonio et al, 2008). 두 번째 변이를 보인 dsHma 08의 유전자는 호리비단벌레(Agrilus planipennis)의 유전자로 RNA-binding protein과 관련된 유전자이다(Table 5). RNA-binding protein (RBP)는 세포에서 single 혹은 double stranded RNA와 결합하고 ribonucleoprotein 복합체를 형성하는데 포함되는 단백질을 말한다. RBP는 생물에서 수 많은 역할을 하는데, 그 중 splicing이나 polyadenylation, mRNA stabilization, mRNA localization, translation과 같이 유전자 발현에 있어서 RNA의 전사후 조절에 주요한 역할을 한다(Hogan et al., 2008; Glisovic et al., 2008). 따라서 호리비단벌레와 같은 딱정벌레목인 무당벌레에서도 RNA-binding protein의 유전자로서 작용할 수 있으며, dsHma 08을 주입한 무당벌레의 표현형을 관찰하였을 때, 용화, 우화 모두 완전하게 탈피를 하지 못하고 죽은 것을 확인할 수 있었다(Fig. 7). 이는 탈피에 관여하는 유전자 발현에 있어서 dsRNA가 작용하여 탈피가 억제되었을 것이라고 생각된다. 이 외에도 Drosophila에서 RNA-binding protein R2D2를 이용하여 RNAi pathway를 연구하였고(Liu et al., 2003), 이를 토대로 누에나방(Bombyx mori)과 거짓쌀도둑거저리(Tribolium castaneum)에 RNAi 시켜 RNA-binding protein R2D2와 Translin의 발현을 가지고 RNAi pathway를 연구가 보고된 바 있다(Swevers et al. 2011).
본 연구에서는 LITMUS 28i vector에 클로닝되어 있는 무당벌레 cDNA library stock cell을 두 가지 방법으로 형질전환하여 유전자 스크리닝 하여 유전자를 선발하였다. in vitro> transcription을 통해 삽입유전자가 확인된 random gene을 double-straned RNA로 합성한 후, 무당벌레 4령 유충의 복부에 주입하여 표현형 변이를 관찰하였다. 초시무늬에 관한 표현형 변이는 나타나지 않았지만, 다른 두 가지의 표현형 변이를 확인하였다. 정확한 유전자 확인을 위해서 RACE를 통해 유전자의 full sequence를 알아내고 그 정보를 확인함으로써, 아직 많은 연구가 되어있지 않은 무당벌레 유전자뿐만 아니라 같은 방법을 통하여 다른 곤충의 유전자 기능 분석에도 도움이 될 수 있을 것이라고 사료된다.
Conclusion
본 연구는 무당벌레의 새로운 유전자 탐색을 위하여 선행연구로 제작한 LITMUS 28i vector에 클로닝한 무당벌레 cDNA library stock cell을 이용하여 두 가지 방법으로 형질전환 시켜 random gene 스크리닝 하였다. 각 유전자의 기능분석을 위해 in vitro> transcription 과정을 통하여 double-stranded RNA를 합성하고 주입하여 표현형 변이를 관찰하였다. 무당벌레 cDNA library를 E.coli DH5α competent cell에 열 충격을 가하여 형질전환한 결과 95개의 콜로니를 얻었으며, Electroporator를 이용하여 E.coli 10B competent cell에 전기충격 형질전환 시킨 결과 5.71 × 104의 적정농도를 얻어 효율을 높였다. 형질전환으로 얻은 cDNA library에서 임의로 콜로니를 선택하여 삽입유전자를 확인한 결과, E.coli 5α competent cell에서 약 150 - 500 bp의 크기인 18개의 삽입유전자를 확인할 수 있었고, E.coli 10B competent cell에서 약 130 - 500 bp의 크기인 24개의 삽입유전자를 확인할 수 있었다. 삽입유전자가 확인된 무당벌레 cDNA library 유전자의 염기서열을 알기 위해 42개의 표본을 염기서열분석(Macrogen) 의뢰했으며, 그 결과 무당벌레 유전자 1개, 곤충 유전자 21개, 다른 종 20개의 상동성을 보이는 유전자를 확인하였고 곤충 유전자 21개 중 13개가 딱정벌레목 곤충의 유전자였다. 유전자 스크리닝 결과 알아낸 유전자들 중 14개의 유전자를 in vitro> transcription을 통해 약 300 - 700 bp 크기의 double stranded RNA를 합성하였다. 무당벌레의 종령인 4령 유충에 합성한 double stranded RNA를 복부에 주입하여 표현형 변이를 관찰했으며, 그 결과 두 가지 유전자에서 표현형 변이가 보였다. 증류수를 주입한 개체의 알은 산란하지 3일이 지나고 부화했지만, dsHma 06을 주입한 개체의 알은 1주일이 지나도 부화하지 않고 쪼그라들고 색이 더 진해졌다. dsHma 08을 주입한 개체들의 다수가 용화 혹은 우화를 채 마치지 못하고 탈피 도중에 치사했다.
