Introduction
세계 전망에 따르면, 전 세계 인구는 대략 90억에 이르게 되고 증가하는 인구 수로 인해 식량문제와 같은 다양한 문제를 일으킬 전망이다(Wise, 2013). 인구수가 증가함에 따라 각종 유기 폐기물이 증가하고 관리하는 것이 중요하다(Surendra et al., 2016). 또한, 동물들의 주요 단백질 공급원인 대두의 제한적인 공급은 인간과 가축의 수요 측면에서 경쟁을 야기 시킬 수 있으며, 대체 가능한 원료에 대한 연구가 진행되었다(Kim et al., 2016; Kim et al., 2017; Schiavone et al., 2017). 뿐만 아니라, 증가하는 대두 가격은 축산업의 생산성에 있어서 커다란 문제가 될 수 있다. 이러한 문제들을 해결하기 위해 대두유 대체제가 필요하고, 대체제로 동애등에 유충(black soldier fly larvae, BSFL)이 각광 받고 있으며, 여러 연구자들에 의해 연구가 진행되었다(Schiavone et al., 2017; Schiavone et al., 2018; Cullere et al., 2019).
동애등에 유충은 상한 음식이나 분과 같은 유기성 물질을 분해할 수 있는 능력과 식이 원료로 쓰일 수 있다는 장점을 가지고 있다(Sheppard et al., 1994; Surendra et al., 2016). 동애등에 유충은 유기물을 분해하여 번데기 과정을 위해 단백질과 지방을 몸 속에 저장하며 섭취하는 물질에 따라 체내 영양소 조성이 달라진다(Newton et al., 2005; Surendra et al., 2016). 섭취하는 물질의 영양분 조성에 의해 유충 체내 영양분의 조성이 달라지긴 하지만, 대체적으로 단백질이 40%, 지방이 30%가량 함유되어 있으며, 이러한 조성은 양계 산업에서 단백질과 지방 공급원의 가능성을 보여준다(Sheppard et al., 1994; Newton et al., 2005; Lock et al., 2016). 또한 동애등에유(black soldier fly larvae oil, BSFLO)를 대두유 50%와 100%를 대체하여 닭에게 급여한 결과 성장률에 차이가 없었으며, 이러한 결과는 동애등에유가 대두유 대체제로 사용 가능하다는 것을 의미한다(Schiavone et al., 2017; Schiavone et al., 2018). 하지만, 동애등에유를 대두유로 대체하였을 때, 장내 미생물 균총에 미치는 영향에 관한 연구가 부족하다. 따라서, 본 연구는 대두유를 동애등에유로 대체하여 육계 사료에 급여하였을 때 맹장 미생물에 어떠한 영향이 있는지를 알아보고자 실시하였다.
Materials and Methods
공시동물, 실험 설계 및 처리구
1일령의 육계(Ross 308)를 총 210수를 공시하여 총 5주간 수행하였으며, 공시 체중을 고려하여 케이지당 7수씩 10반복으로 배치하였다. 각 케이지에는 자동 급여기와 음수기를 설치하였고 자동환기시스템으로 온도를 조절하였다. 공시 사료로 옥수수와 대두박 배합사료를 급여하였으며, 배합사료의 원료 구성 및 배합비는 Table 1에 표시하였다. 배합사료는 초생추, 육성전기 및 육성후기로 나누어 배합하였고 자유채식하도록 급여하였다. 처리구의 사료에는 동애등에유를 대두유 50% (50 BSFLO)와 100% (100 BSFLO)를 각각 대체하여 급여하였다.
조사 항목 및 조사 방법
동애등에유의 지방산 조성 분석
동애등에유 내에 존재하는 지질을 추출하기위해 chloroform과 methanol을 1 : 2로 혼합하여 사용하였고, H2SO4를 사용하여 메틸전이반응을 통해 fatty acid methyl esters (FAME)를 분석하였다. FAME은 7890A 가스크로마토그래피(Agilent Technologies, Wilmington, USA)를 사용하여 분석 후, 분석된 모든 FAME에 대한 각각의 지방산의 비율을 표로 나타내었다(Table 2).
맹장 내용물 채취 및 DNA샘플 준비
35일령에 처리구 당 6마리씩 임의선발하여 도계 후, 맹장을 적출하여 내용물을 채취하였고, 채취 후 바로 액체질소에 넣은 후 - 80℃에 분석 전까지 보관하였다. 5 g의 맹장내용물을 Ringer’s solution으로 1 : 10비율로 희석하고 2분동안 균질화 후, 샘플 1 mL를 4℃에서 원심분리 하였다. 원심분리 후, fast-DNA spin kit (MP Bio Laboratories, USA)를 사용하여 DNA를 추출하여 - 20℃에 시퀀싱 전까지 보관하였다.
16S rRNA 유전자 시퀀싱
추출된 DNA샘플의16S ribosomal RNA (16S rRNA) 유전자를 증폭하였고 증폭된 DNA샘플은 정방향 프라이머 341F (5’-CCTACGGGNGGCWGCAG-3’)와 역방향 프라이머805R (5’-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3’)을 사용하여 400 - 500 bp 사이에서 18개의 amplicon을 생성하였으며, 마크로젠(Macrogen, Inc., Seoul, Korea)에서 MiSeq 플랫폼(Illumina, San Diego, USA)을 사용하여 시퀀싱하였다.
통계 분석
실험 결과는 SAS프로그램(SAS Inst. Inc., Cary, USA)의 GLM procedures를 이용하여 진행하였으며, 처리구간 유의적 차이는 Tukey검정에 의해 95% 유의수준으로 분석하였다.
Results and Discussion
일반적으로 동애등에 유충의 지방산 조성의 경우, 대체적으로 포화지방산(saturated fatty acid, SFA)의 함량이 불포화지방산(unsaturated fatty acid, USFA) 함량보다 높고, 포화지방산 중에서도 라우릭산(lauric acid)의 함량이 가장 높다(Makkar et al., 2014). 라우릭산은 탄소수 6 - 12개로 구성된 중쇄지방산(medium-chain fatty acid, MCFA)의 한 종류이며, 코코넛 오일 안에 높게 함유된 지방산이다(Suzuki, 2013). 중쇄지방산은 세균의 세포질을 투과하여 사멸시키는 항균성을 가지고 있어 장 건강을 위한 천연 항생제로써 사용될 수 있을 것으로 보인다(Zeitz et al., 2015; Spranghers et al., 2018).
본 실험에서 사용된 동애등에유 내에 존재하는 지방산 성분을 분석한 결과(Table 2), 포화지방산의 함량이 59.1%, 단일불포화지방산(mono-unsaturated fatty acid, MUFA)의 함량이 20.40%, 그리고 다가불포화지방산(poly-unsaturated fatty acid, PUFA) 함량은 16.97%였다. 포화지방산 내에서 가장 많이 함유된 지방산은 라우릭 산(C12:0)이며, 35.72%로 전체 지방산 중에서 대략 3분의 1가량 동애등에유 내에 함유되어 있었다.
대조구 사료 내 대두유를 동애등에유로 50%와 100% 대체하였을 때, 육계 맹장 소화물 내 박테리아 군집의 차이를 시퀀싱하였다. 그 결과 OTUs, Chao 1, Shannon 및 Simpson과 같은 다양성 지표는 처리구간 유의적인 차이를 보이지 않았다(Table 3). 또한, 박테리아 군집 구성을 문 단위로 정리한 결과, 주요 문은 Firmicutes, Proteobacteria 및 Bacteroidetes로 분석되었다(Fig. 1). Firmicutes는 세 처리구 모두 90%이상으로 가장 높은 비율을 보여 주었으며, 50% 대체한 처리구(96.02%)와 100% 대체한 처리구(94.45%) 모두 대조구(97.40%)에 비해 낮았다. 하지만, Proteobacteria는 동애등에유를 급여한 두 처리구(3.19, 3.03%) 모두 대조구(1.92%)보다 상대적으로 높았다. 박테리아 군집 구성을 속 단위로 정리한 결과, 총 125개의 속이 분석되었으며, 117개의 속이 Firmicutes문, 6개의 속이 Proteobacteria문, 1개의 속이 Bacteroidetes문, 그리고 1개의 속이 Actinobacteria문으로 분류되었다. 속 분석결과에서 1% 미만은 others로 분류하고 나머지 16개의 속을 표로 나타내었다(Fig. 1). 닭의 장내 미생물 중 주요 미생물로 알려진 Faecalibacterium속이 세 처리구 모두 가장 높은 비율(50% 이상)로 존재하였으며, Ruminococcus가 다음으로 높았다. Firmicutes문에 속하는 속 중에서 Faecalibacterium속은 50% 대체한 처리구(56.89%)에서 대조구(60.75%)에 비해 낮았다. 일반적으로, Faecalibacterium속은 단쇄지방산 중 하나인 butyrate를 생성하여 장상피세포를 강화해 장융모발달에 유익한 미생물로 알려져 있다(Miquel et al., 2013; Gangadoo et al., 2018). 동애등에유를 첨가한 두 처리구(5.22, 3.92%) 모두 대조구(7.66%)에 비해 Ruminococcus속 비율이 낮았으며, Lactobacillus속은 동애등에 대체 비율이 증가할수록 감소하였다(3.84, 2.64, 및 1.45%). Ruminococcus속은Ruminococcaceae과에 속하는데, Ruminococcaceae과에 속하는 미생물들은 셀룰로오스를 분해하여 단쇄지방산을 생성한다고 알려져 있다(Liu et al., 2008; Li et al., 2017). 하지만, Proteobacteria문에 속하는 Escherichia속은 동애등에유를 첨가한 두 처리구 모두 대조구에 비해 높았다(1.91, 3.17 및 3.03%). 문과 속 수준에서 처리구간 미생물 균총 차이를 통계분석 및 비교를 한 결과(Fig. 2), 대부분의 미생물들이 유의적인 차이가 없었으나, 속 수준에서 Erysipelatoclostridium속이 50% 대체한 처리구(2.21%)가 대조구(0.68%)보다 유의적으로 높았다(p <0.05). 이전 연구결과에 의하면 육계에게 중쇄지방산을 급여하였을 때 Erysipelatoclostridium속이 증가하였는데, 대두유보다 상대적으로 높은 동애등에유의 중쇄지방산 함량이 균총에 영향을 준 것으로 보인다(Kers et al., 2019). 하지만, 주성분분석(principal coordinates analysis, PCoA)을 한 결과, 결과적으로 처리구간 미생물 균총 차이는 보이지 않았다(Fig. 3).
Fig. 1. Microbial taxonomic profiles from the cecal digesta of the three dietary treatments at the phylum (A) and genus (B) levels. The taxonomic composition of the cecal microbiota among the treatment groups was compared based on the relative abundance (taxon reads/total reads in the cecal digesta). CON, control diet; 50 BSFLO, 50% black soldier fly larvae oil diet; 100 BSFLO, 100% black soldier fly larvae oil diet.
Fig. 2. Relative abundances of the cecal microbiota between the control, 50 BSFLO, and 100 BSFLO groups. Variations in the relative abundance of the cecal microbiota at the phylum (A) and genus (B) levels. Different letters indicate significant difference (p < 0.05). CON, control diet; 50 BSFLO, 50% black soldier fly larvae oil diet; 100 BSFLO, 100% black soldier fly larvae oil diet.
Fig. 3. Principal coordinates analysis (PCoA) plots based on weighted UniFrac distance metrics. Individual samples for treatments are designated with the following symbols: CON (red, ○), 50 BSFLO (blue, △), and 100 BSFLO (orange, □). CON, control diet; 50 BSFLO, 50% black soldier fly larvae oil diet; 100 BSFLO, 100% black soldier fly larvae oil diet.
동애등에유를 사용하여 대두유를 대체 급여한 결과, 맹장 내 미생물 균총이 바뀌었지만, 부정적인 영향을 끼치진 않았다. 이러한 결과는 사료 내 첨가된 지방 원료(대두유와 동애등에유) 내 지방산 조성의 차이로 보여진다. 동애등에유의 중쇄지방산은 다른 지방산보다 극성의 성질과 짧은 탄소 수 때문에 소장상부에서 흡수가 빨라 대장까지 도달하기 힘든 특성을 가지고 있다(Zeitz et al., 2015; Belghit et al., 2019). 또한, 라우릭 산은 주로 그람 양성균을 억제하며, E. coli나 Salmonella spp.와 같은 그람 음성균에는 효과가 약하다(Skrivanova et al., 2005; Hermanns et al., 2010). 하지만, 중쇄지방산은 장쇄지방산에 비해 소장 상부에서 빠르게 흡수되는 특성 때문에 소장 상부의 융모 발달에 효과가 있으며, 이는 중쇄지방산이 직접적으로 장 상피세포에 에너지원으로 쓰였기 때문이다(Zentek et al., 2012). 이러한 중쇄지방산의 특성 때문에 동애등에유를 급여하였을 때, 맹장 미생물에 미치는 영향이 적은 것으로 판단된다.
