Introduction
뿌리털은 뿌리표피의 특정 단일세포가 생장하여 형성된 것으로, 식물의 토양과 접촉 면적을 증가시켜 토양 양분의 흡수에 중요한 역할을 한다(Itoh and Barber, 1983; Clowes, 2010). 특히 토양 이동성이 적은 인산의 흡수 능력을 결정하는 중요한 결정 요인이다(Gahoonia et al., 1997).
작물인 보리(Hordeum vulgare L.)에서 뿌리털의 발생이 저해된 돌연변이 식물체 Hvbrb (bald root barley)를 낮은 인산 조건에서 재배하였을 때 심각한 생장 저해가 나타났으며(Gahoonia and Nielsen, 2003), 보리의 품종별 뿌리털의 길이차이와 각 품종별 인산 공급량에 따른 곡물 생산량의 변화를 관찰한 실험에서는 뿌리털의 길이와 곡물 생산량이 정의 상관관계가 있음이 보고되었다(Gahoonia and Nielsen, 2004).
Brachypodium distachyon은 화본과 식물의 생물학적 연구에 적합한 모델식물로 밀, 보리 등과 진화학적으로 밀접한 관계가 있는 식물로 분류된다(Opanowicz et al., 2008). 농업적으로 중요한 대부분의 작물이 큰 게놈 크기와 긴 생활환을 갖는 반면 Brachypodium은 상대적으로 게놈(~ 275 Mb) 크기가 작아 화본과 작물의 생물학적 연구에 적합한 조건을 갖추고 있다(Garvin et al., 2008; Brkljacic et al., 2011). 또한 식물체의 크기도 기내 실험에서 다루기가 용이하며, Agrobacterium을 이용한 형질전환도 용이하여 유전공학 연구를 위한 식물 재료로서 큰 장점을 갖고 있다(Alves et al., 2009).
유전공학의 발달로 작물에서 뿌리털 발달에 관련된 연구도 상당히 진행되고 있다(Dolan, 2017). 작물의 뿌리털 발달에 중요한 유전자인 RSL (root hair defective six like) 유전자가 rice와 Brachypodium에서 각각3개의 유전자가 존재하는 것이 확인되었으며, 이들 유전자의 기능에 대한 연구도 수행되고 있다(Kim and Dolan, 2016; Kim et al., 2017). RSL 유전자는 단자엽 식물에서 뿌리털의 발생과 길이 생장에 중요한 역할을 하는 것이 증명되었으며, RSL 유전자의 과발현 식물체에서는 뿌리털의 수와 길이가 대조계통(control)과 비교하여 상당히 증가한 것이 관찰되었다. 또한 Brachypodium RSL유전자 그룹(BdRSL1, BdRSL2, BdRSL3)에 옥수수 UBI 프로모터(Zae mays Ubiquitin promoter)로 조절되는 과발현 식물체를 생산하고, 이들 식물체를 이용한 양분흡수 능력을 평가하는 연구에서도 유전자의 과발현으로 뿌리털이 신장된 식물체에서 양분의 흡수능력이 증가한 것이 보고되었다(Kim and Dolan, 2016; Zhang et al., 2018).
본 연구에서는 Brachypodium에서 RSL유전자 그룹에 속하는 유전자를 과발현한 형질전환식물체를 이용하여 뿌리털 길이의 신장 및 수의 증가가 Brachypodium의 수확량 증가에 미치는 영향을 평가하였다.
Materials and Methods
식물재료 및 재배방법
Brachypodium distachyon (line Bd21)을 실험의 재료로 사용하였다(Garvin et al., 2008). 종자를 0.1% Triton X-100가 첨가된10% 차염소산나트륨에서 5분간 소독한 후 멸균수로 세척하였다. 균일한 발아를 위해 젖은 멸균페이퍼 위에 종자를 올려놓은 후 5℃에서 2일간 처리하였다. 소독된 종자는 1%의 sucrose와 0.5% phytagel이 첨가된 phosphate 배지(Ma et al., 2001)에서 발아시켜 5일 후 뿌리털의 발생과 길이를 관찰하였다. 또한 토양 파종을 위한 종자는 소독 후 23℃ 인큐베이터에서 2일간 발아과정을 거쳐 종자를 John Innes Composts no. 1 (0.6 kg ground limestone per bag, 1.2 kg hoof and horn meal per bag, 1.2 kg superphosphate per bag, 0.6 kg potassium sulphate per bag) 상토에 파종하고, 23℃, 16/8시간(light/dark) 일장조건에서 생장시켰다.
형질전환체 제작
형질전환 Brachypodium 식물체는 Dr. Philippe vein 그룹(John Innes Centre, Norwich, UK)에서 분양받은 pVec8 vector를 사용하여 제작되었다.
Brachypodium (Brachypodium distachyon 21 inbred line) 종자를 70% ethanol과 5% 차염소산나트륨으로 소독한 후 멸균수로 세척하여 상토에서 7 - 9주 동안 키웠다. 이삭이 출현하면 멸균 상태에서 0.3 mm 길이의 immature embryo를 분리하여 MSB3 배지(100 mL Macro MS salts stock solution, 10 mL Micro MS salts stock solution, 10 mL Fe-EDTA stock solution, 30 g sucrose, 2.5 mL 2,4-D [1 mg·mL-1], 2 g Phytagel, pH 5.8) 위에 올려 25℃ 암조건에서 캘러스가 형성될 때까지 6주 동안 계대배양(3주/2주/1주)을 하였다. Ti-plasmid vector가 도입된 A. tumefaciens cell은 MGL 배지에서 OD600 = 1 로 조정한 후, 캘러스와 함께 7분간 감염 후 MSB3 배지에 옮겨 2일간 공동 배양하였다. Agrobacterium에 의해 감염된 캘러스는 40 mg·L-1 hygromycin과 700 mL의 Timentin (320 mg·mL-1)이 포함된 MSB3 배지에 옮겨 형질전환 캘러스를 선발하였다. 선발된 캘러스를 MSR26 (100 mL Macro MS salts stock solution, 10 mL Micro MS salts stock solution, 10 mL Fe-EDTA stock solution, 30 g sucrose, 2 mL kinetin [0.1 mg·mL-1], 10 mL M5 vitamins stock solution, 400 mL hygromycin B [50 mg·mL-1], 700 mL timentin [320 mg·mL-1] 2 g Phytagel, pH 5.8)에 옮겨 신초를 형성시켰고, MS 배지에서 발근시킨 후 순화과정을 거쳐 포트에 이식하였다(Kim and Dolan, 2016). 선발된 T2 종자를 뿌리털의 발달과 식물체의 건물중 및 수량 구성요소의 측정에 사용하였다.
뿌리털 길이 측정
발아후 5일 된 식물체의 뿌리를 Nikon Eclipse E600 epifluor- escence light microscope (Nikon, Tokyo, Japan) 장비 를 사용하여 관찰하고 Leica DFC310 FX 카메라를 통해 촬영하였다. 촬영을 통해 확보한 ImageJ 프로그램(https://imagej.net/)을 통해 분석하였다.
건물중 및 수량구성요소 측정
종자소독 후 실내에서 발아시킨 종자를 John Innes Composts no. 1 (0.6 kg ground limestone per bag, 1.2 kg hoof and horn meal per bag, 1.2 kg superphosphate per bag, 0.6 kg potassium sulphate per bag) 상토에 파종한 후, 23℃와 16/8시간(light/dark) 일장조건에서 6주간 재배하며 생육을 관찰하였다. 식물체 지상부의 건물중과 수량구성요소(분얼수, 이삭수, 이삭무게)는 토양 이식 후 8주간 재배하여 완전히 건조시킨 각 라인별 10개 식물체를 이용하여 측정하였고, 엑셀프로그램(Excel 2013, Microsoft, Washington, D.C., USA)을 이용하여 통계 분석을 수행하였다.
Results and Discussion
BdRSL
BdRSL 그룹 유전자(BdRSL1, BdRSL2, BdRSL3)의 뿌리털 발달과의 상관관계를 조사하기 위해 BdRSL 과발현 vector pVec8:BdRSL을 이용하여 Brachypodium (bd21 inbred line)에 형질전환을 수행하였다(Kim and Dolan, 2016).
유전자의 도입이 확인된 형질전환식물(T0)은 토양에 순화하여 재배한 후 종자를 수확하였고, 수확한 종자를 hygromycin이 포함된 배지에 파종하여 T1 식물을 선발하였다. 선발된 T1 세대 형질전환식물에서의 BdRSL 그룹 유전자의 발현량은 quantitative real-time PCR을 수행하여 분석하였고 발현값 보정에는 내부 대조 유전자인 Ubiquitin 유전자를 이용하였다(Table 1). 그 결과 형질전환식물에서의 BdRSL1, BdRSL2, BdRSL3 그룹 유전자의 발현은 대조 계통(wild-type) 대비 각각 50, 200, 600배 증가하였다(Table 1). 또한 선발된 형질전환식물의 뿌리털 길이를 측정한 결과, BdRSL1, BdRSL2, BdRSL3 그룹 유전자가 각각 도입된 모든 형질전환식물에서 대조 계통에 비해 100% 이상 증가한 것으로 나타났다(Fig. 1; Kim and Dolan, 2016). 반면 뿌리의 생장은 대조계통에 비해 짧아진 것이 관찰되었다(Table 1). 뿌리생장이 짧아진 원인을 확인하기 위하여 뿌리 표피세포의 길이를 측정해 본 결과 뿌리털의 길이 생장으로 뿌리표피세포에서 대조계통에 비해 세포의 길이 생장이 이루어지지 않아 전체적인 뿌리의 생장이 짧아진 결과를 가져왔음을 확인할 수 있었다.
이와 같은 결과는basic helix-loop-helix transcription factor인 BdRSL 그룹 유전자가 뿌리털의 길이 생장에 중요한 역할을 하고 있음을 시사한다.
형질전환식물의 biomass 변화
BdRSL 그룹 유전자가 과발현된 형질전환식물의 양분 흡수능력을 평가한 연구에서 형질전환식물의 인산 이용효율이 높아짐이 보고된바 있다(Zhang et al., 2018). 인산의 이용효율이 높아진 형질전환식물은 식물체의 biomass도 증가할 것으로 추정하고 BdRSL 그룹 유전자가 과발현된 Brachypodium 형질전환식물의 biomass 분석 관련 실험을 수행하였다.
종자 파종 후 8주간 재배한 형질전환식물을 완전히 건조된 상태로 수확하여 biomass를 측정하였다. 완전 건조된 식물체는 지상부가 증가된 표현형이 관찰되었고(Fig. 2), 각 형질전환식물을 계통 별로 10개체의 무게를 측정한 결과 대조계통(wild-type)의 무게가 1.64 ± 0.13 g인 것에 비해 UBI:BdRSL1, UBI:BdRSL2, UBI:BdRSL3은 각각 2.96 ± 0.51 g, 3.59 ± 0.54 g, 4.28 ± 0.62 g으로 지상부의 무게가 증가한 것으로 나타났다. 통계 분석 결과 형질전환식물의 지상부 무게는 대조계통에 비해 유의한 차이로 증가되었음이 확인되었다(Fig. 3).
본 결과는 동일 품종의 식물에서 뿌리털의 길이가 길어진 계통은 양분의 이용 효율이 증가되어 결과적으로 지상부의 건물중이 증가될 수 있음을 시사한다.
형질전환식물의 수량 구성 요소 변화
작물에서의 분얼 수, 이삭 수 및 이삭의 무게는 중요한 수량 구성 요소들이다.
RSL 그룹 유전자가 도입된 형질전환식물 UBI:BdRSL1, UBI:BdRSL2, UBI:BdRSL3 계통 각각 10개체를 대상으로 수량 구성요소를 조사하였다. 분얼 중 유효분얼은 이삭의 수를 결정하는 중요한 표현형 중의 하나이다. Brachypodium에서 유효분얼을 발생시키는 요인에 대한 연구가 부족하지만 형질전환식물은 대조계통 (wild-type)의 유효분얼에 비해 유의한 차이로 증가되었음이 확인되었다. 따라서 형질전환 식물의 유효분얼경 수의 증가가 유전자의 발현과 밀접한 관계가 있다고 할 수 있다.
UBI:BdRSL1, UBI:BdRSL2, UBI:BdRSL3의 분얼경의 수는 대조계통에 비해 각각84, 91, 114% 증가되었다. 결과를 student t-test로 통계분석하여 p < 0.01 수준의 유의차를 보이며 증가된 것을 확인하였다(Fig. 4).
이삭의 수와 무게를 조사한 결과, 이삭 수는 UBI:BdRSL1, UBI:BdRSL2, UBI:BdRSL3 형질전환식물에서 대조계통에 비해 각각 62, 102, 104% 증가된 결과를 보였고(Fig. 5A), 이삭의 무게에서도 각각 24, 44, 31%의 증가가 확인되었다(Fig. 5B).
이들 결과에서 뿌리털의 수가 증가하고 길이 생장이 촉진된 형질전환 식물은 수량 구성 요소가 통계적으로 유의하게 증가됨이 확인되었고, 이는 뿌리털의 수 및 길이의 생장은 양분 흡수 효율성을 증가시켜 식물의 biomass 함량을 증가시키는데 영향을 미칠 수 있음을 시사한다.
Fig. 5. Grain yield components. (A) Total spikelet number of Brachypodium lines (wild-type, UBI:BdRSL1, UBI:BdRSL2, and UBI:BdRSL3). (B) Spikelet weight of Brachypodium lines (wild-type, UBI:BdRSL1, UBI:BdRSL2, and UBI:BdRSL3). Data shown are means ± SE (n = 10). *, ** denote significant differences for the calculated values p < 0.05, p < 0.01, respectively.
Conclusion
뿌리털의 길이와 수확량의 연관관계에 대한 연구는 작물(보리, 옥수수)을 중심으로 수행되어 왔고, 뿌리털의 길이가 길어진 품종에서 인산의 흡수와 수확량이 증가됨이 보고된바 있다(Gahoonia and Nielsen, 2004).
본 연구에서는 유전자 기능연구를 기반으로 최신 형질전환기술을 활용하여 뿌리털이 길어진 화본과 작물의 수량성 증가에 대해 평가하였다. 유전자의 조절로 현대 육종가들이 원하는 길어진 뿌리털의 초형을 갖는 식물체를 만들고, 개선된 형질을 이용하여 뿌리털과 수량증가와의 상관관계를 분석하여 생명공학기술로 뿌리털의 형태를 조절하여 수량을 증가시킬 수 있음을 확인하였다. 연구의 재료로 이용된 Brachypodium은 단자엽 식물의 모델식물로 전세계적으로 단자엽 식물연구에 활용가치가 높은 화본과 식물이다. Brachypodium은 거의 모든 화본과 식물의 유전자를 포함하고 있어 유전체 연구를 위한 좋은 재료이다. 화본과 모델식물인 Brachypodium에서의 유전체 연구는 진화학적으로 최근에 분리된 식량작물인 벼, 밀, 보리, 옥수수에 활용이 가능하다는 장점을 갖추고 있다.
