Introduction
유전자변형생물체(living modified organism, LMO)란 현대생명공학기술을 이용하여 인위적으로 새롭게 조합된 유전물질을 포함하고 있는 생물체(동물, 식물, 곤충, 미생물 등)를 말한다(유전자변형생물체의 국가간 이동 등에 관한 법률 제2조). 2020년은 LM작물이 도입된 지 24년째가 되는 해로 1996년에 비해 112배까지 증가했으며 이는 세계에서 가장 빠르게 채택된 작물 기술이다. 1996년부터 2020년까지 생명공학의 총 누적 면적은 27억 헥타르에 이른다. LM작물 재배면적은 2018년에 26개국이 1억 9,170만 헥타르 재배되었고, 2019년에는 29개국이 2018년보다 130만 헥타르 감소한 1억 9,040만 헥타르이다(James, 2019). 국외는 농업생명공학응용을 위한 국제 서비스(International Service for the Acquisition of Agri-biotech Applications, ISAAA)에서 제공되는 정보에 따르면 세계 LMO 안전성 심사 품목은 2021년 6월 ISAAA기준 29개국에서 32작물 530품목이 심사 승인 되어 있고, 대두 1개(GMB 151), 옥수수 2개(MON 87429, DP-202216), 감자 1개(Z6)가 추가 승인되었다(ISAAA, 2020). 국내는 한국 바이오 안전성정보센터(Korea Biosafety Clearing-House, KBCH; https://www.biosafety.or.kr/)에서 제공하는 정보에 따르면 국내에서 유전자 변형 옥수수 변형 대두, 옥수수, 면화, 카놀라 등은 식품 및 사료 목적으로 2020년 기준 총 1,197만 톤(식품용 198.5만 톤, 사료용 998.8만 톤)이 수입 승인되었다. 그 중 식품용은 7개작물, 178품목에 대해 승인되었으며, 콩(29건), 옥수수(92건), 면화(30건), 카놀라(17건), 감자(4건), 알팔파(5건), 사탕무(1건)이였고, 농업용은 5개 작물, 총 170건에 대해 승인되었으며, 콩(29건), 옥수수(88건), 면화 (31건), 카놀라(17건), 알팔파(5건) 이였으며, 식품용은 감소하는 반면 농업용은 꾸준히 증가하고 있다(KBCH, 2020). LMO개발은 인구 증가, 경작지 감소, 기후 변화 등에 대비하여 안정적 식량확보하기 위한 중요한 농업 기술이 되었다(Park et al., 2019). 국내의 경우, 시험연구용을 제외하면 아직 LM작물의 상업적 재배가 승인된 사례는 없으나, 식용 또는 사료용으로 수입 및 유통되는 과정에서 비의도적인 환경 방출 우려가 높아지고 있다(Park et al., 2012; Han et al., 2016). LMO를 진단하는 기술에는 도입된 유전자의 DNA를 검출하는 방법과 도입된 유전자에 의해 발현되는 단백질을 검출하는 방법이 있다(Jeong, 2013). LMO 검출에 일반적으로 이용되는 있는 PCR (polymerase chain reaction)분석법을 기반으로 하여 스크리닝(screening), 유전자 및 구조 특이적(gene and construct-specific), 계통 특이적(event-specific)이 있다(Salisu et al., 2017). 작물에 도입된 유전자들은 개발사(monsanto: cp4epsps, dupont: gat4621, bayer: mEPSPS 등), 목적 등에 따라 LMO특성(해충 저항성, 제초제 저항성 등) 및 도입유전자의 발현조절부위(프로모터, 터미네이터) 등이 있다(Kim et al., 2011). LM작물의 유전정보는 비의도적 혼입 방지 및 자원의 건전성 확보를 위한 모니터링으로 이용될 LM작물 검정 개발을 위한 기초 정보로 매우 중요하다(Woo et al., 2009). 향후 LMO 모니터링을 대비하여, 여러 이벤트를 동시에 검정할 수 있는 multiplex PCR검정법을 개발하여 시간 및 비용, 인력을 감소할 수 있을 것이다. LM작물의 multiplex PCR 검출법은 LM 대두, 옥수수, 면화, 카놀라 등에 보고되고 있다(Kim et al., 2001; Jo et al., 2015; Seol et al., 2015; Jo et al., 2016; Shin et al., 2016; Seol et al., 2017). 「유전자변형생물체 국가간 이동 등에 관한 법률」 별표 10-1항에 의거하여 LMO승인을 위한 표준품 관리 및 국내 유통 및 수입 시 모니터링을 위해 판별 커가 필요하다. 본 연구는 국내외 상업화 승인 LM작물의 유전자 정보를 수집/분석하여, LM작물의 판별 마커 및 검출 방법의 개발을 목적으로 수행되었으며, 본 연구의 결과는 향후 국내 농업 자원에 대한 LMO 비의도적 혼입 방지 및 자원의 건전성 확보를 위한 모니터링 방법으로 이용될 수 있을 것이라 생각된다.
Materials and Methods
국내외 LMO 유전정보 조사 및 승인 현황
주요 LMO 이벤트에 대해 LM작물의 도입 유전자 구조 및 유전자 변형 기술에 대한 정보를 수집하기 위해 농업생명공학응용을 위한 국제서비스(ISAAA) 및 바이오안전성정보센터(Biosafety Clearing-House, BCH)을 활용하였다. 본 연구에서는 이 같은 2개의 연구 기관이 제공하고 있는 정보를 바탕으로 동시증폭검출법 개발 대상에 대한 작물 별 특성 및 도입유전자의 구성요소 등에 대한 정보(BCH, 2020)를 조사하여 Table 1 - 3에 정리하였다. 국내외 LM작물 상업화 및 재배 승인된 폼목에 대한 현황을 수집하기 위해 농업생명공학응용을 위한 국제서비스(ISAAA) 및 한국바이오안전성정보센터(KBCH)를 활용하였다.
표준 물질
본 실험에 사용된 LM작물들의 인증 표준 물질(certified reference materials, CRMs)은 표준 물질 및 측정 연구소(Institute for Reference Materials and Measurements, IRMM) 및 미국유지화학 협회(American Oil Chemists' Society, AOCS)로부터 구입하였다. 실험에 사용된 CRM 목록은 Table 4에 나타내었다.
Table 4. Standard samples from IRMM and AOCS.
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AOCS, American Oil Chemists' Society; IRMM, Institute for Reference Materials and Measurements. |
DNA 정제
분말 상태의 인증 표준 물질(CRM) 200 mg을 이용하여 Maxwell® RSC Instrument + Maxwell RSC PureFood GMO and Authentication Kit (Promega, Wisconsin, USA)에서 제공된 매뉴얼에 따라 genomic DNA를 정제하였다. 정제된 genomic DNA는 Nanodrop One (Thermo Scientific, Wilmington, USA)을 이용하여 각 시료의 DNA 농도를 정량 하였으며, 100 ng·μL-1의 농도가 되도록 희석하여 PCR에 사용하였고, 실험 전까지 -20℃에 보관하였다.
PCR primer 제작
국내 수입 및 승인된 LM 이벤트에 대한 PCR법을 확립하기 위해 식품의약품안전청 식품 공전의 유전자재조합식품의 시험법(MFDS, 2021)과 농림축산검역본부 농림축산업용 유전자변형생물체의 국경 검사 세부실시요령(APQA, 2016) 및 유럽위원회 공동연구센터(Joint Research Centre, JRC)에서 제공된 작물 별 유전자 분석법(JRC, 2020)에 고시되어 있는 primer의 서열 정보를 바탕으로 제작하였다. 농촌진흥청에서 유전자원을 검정하기 위해 유전정보들의 서열 정보를 바탕으로 primer를 제작하였다(Shin et al., 2018; Song et al., 2020). 모든 primer는 바이오니아(Bioneer, Daejeon, Korea)에 의뢰하여 합성하였고, PCR 반응 시 10 pM로 희석한 뒤 -20℃에 보관하여 사용하였다(Table 5).
PCR 분석법
PCR 반응 용액은 한 시료 당 총 20 μL로 하여, safe Dry Multiplex PCR PreMix (CellSafe, Yongin, Korea), 각각 10 pM의 forward와 reverse primer, Nuclease-free water, template DNA가 포함되도록 증폭 반응의 혼합액을 조성하여 수행하였다. PCR 반응 조건은 SimpliAmp Thermal Cycler (Applied Biosystem, Darmstadt, Germany)를 이용하여, 95℃에서 5분, 95℃ 30초, 60℃ 30초, 72℃ 30초간 30 cycle로 하였으며, 마지막 단계로 72℃에서 3분 간 수행하였다.
Agarose gel 전기영동 이용법
2.5%의 agarose gel에 PCR이 끝 난 증폭 산물 10 μL와 Dye 1 kb Plus DNA Ladder Maker 2 μL (Dynebio, Seongnam, Korea)를 loading한 후 100 v 전압으로 30분간 전기영동하여 UV transilluminator (Gel Imaging System [Davinch] + MC2000 Software [i-MAX]) 위에 gel을 올려 촬영하여 증폭된 밴드를 확인하였고 화상데이터로 보존하였다.
자동화 전기영동 이용법
PCR 증폭산물들을 agarose gel에서 육안으로 크기를 추정하였다면, 4채널 자동 모세관 전기영동장치(Qsep 400, Bioptic, Taipei, Taiwan)는 S2 (standard) cartridge 및 PCR이 끝 난 증폭 산물 10 μL에 Dilution buffer 10 μL을 합쳐 총 20 μL을 장착 한 후 기기에 내장 된 Q-Analyzer Software (Bioptic, Taipei, Taiwan)를 사용하여 결과를 분석하였다. Gel view (band)와 Electropherogram (peak) 이미지를 동시에 얻을 수 있으며 정량적 분석이 가능하기 때문에 PCR 증폭산물들이 각각의 명확한 크기를 알아내어 LM작물을 판별할 수 있다.
Results and Discussion
국내외 LMO 승인 현황 및 LMO 유전 요소 조사
승인된 LM작물에 대한 유전 요소 조사는 대두, 옥수수, 면화, 카놀라 등 4작목의 144 이벤트(대두 26, 옥수수 47, 면화 40, 카놀라 31)를 대상으로 하였다. 또한 같은 운반체를 이용하여 생산된 다른 이벤트는 동일한 것으로 분류하였고, 두 개의 LM이벤트를 교잡 육종에 의해 생산된 LM후대 교배종 작물은 조사범위에 포함하지 않았다. 조사결과, LM 작물에 사용된 발현유전자는 26개의 LM형질에 따라 60개의 유전자가 조사되었으며 Table 1과 같이 정리하였다. Promoter는 46개가 조사되었으며 P35S가 많이 이용되었다(Table 2). Terminator는 33개가 조사되었으며 tNOS가 많이 이용되었다(Table 3).
농업용 유전자원 검정 체계 구축
유전정보를 활용한 검정
승인된 LM 작물의 유전 요소 분석 결과로 콩(Fig. 1), 옥수수(Fig. 2), 면화(Fig. 3), 카놀라(Fig. 4)의 유전정보 모식도를 통하여 검정 가능한 조합을 작성하였다. 조합에 사용된 것은 promoter (P35S, Pubi10, P-FMV), terminator (T-nos, T-PinII, T-E9), introduced gene (cp4epsps, gat4621, mEPSPS, NPTII, Patba)의 유전자 primer를 이용하여 중합효소연쇄반응을 수행하였고, 2.5% agarose gel과 자동전기영동장치(Qsep 400)에 전기영동 한 결과는 다음과 같다. 대두, 옥수수, 면화, 카놀라 등 4작목의 18 이벤트(대두 5, 옥수수 6, 면화 4, 카놀라 3)에서 도입된 유전정보들이 특이적으로 검출되는 것을 확인하였다(Fig. 5). 1차적으로 LM작물에 보편적으로 사용되는 프로모터 및 터미네이터, 도입 유전자를 이용하여 LMO를 판별하는 방법이지만, 식물 바이러스 및 오염에 의해 잘못 된 양성 반응이 나타날 수 있다는 단점이 있다(Song et al., 2020). agarose gel과 자동전기영동장치(Qsep 400)로 PCR 산물은 확인한 결과 다소 차이를 보였으나, 오차범위내로 인정된다. 이 결과를 바탕으로 농업유전자원을 검정 할 시 Table 6가 같은 대두 7조합, 옥수수 7조합, 면화 7조합, 카놀라 8조합의 primer set를 이용함으로써 농업유전자원의 품질의 안정성을 확보하였고, 생산하는 농업유전자원의 검정을 통한 비의도적으로 혼입되는 LM작물을 사전 폐기하고 수출 시 유전자변형생물체 미포함을 증명하여 작물의 생산 및 수출에 활용할 수 있다.
Fig. 5. Agarose gel and automated capillary electrophoresis system of polymerase chain reaction (PCR) products from soybean and maize. (A) p35S/tNOS, (B) TpinⅡ/Pubi10/T-E9, (C) P-FMV, (D) cp4epsps/gat4621, (E) mEPSPS, (F) NPTⅡ, (G) Patba. Lane 1 - 14: A2704-12, MON87705, FG72, MON89788, SYHT0H2, MON87460, TC1507, MON87411, DAS59122, 98140, MZHG0JG, no template control, non-GM crop, GM crop, cotton and canola. Lane 15 - 24; MON531, MON1445, DAS81910, GHB119, 73496, MON88302, Ms11, no template control, non-GM crop, GM crop. M, size marker.
이벤트 특이적 검정
LM작물의 이벤트 분석을 위해 18개 단일 이벤트의 유전자 특이적 primer를 사용하여 중합효소연쇄반응을 실시하였다. 2.5% agarose gel과 자동전기영동장치(Qsep 400)에 전기영동 한 결과, 18개의 LMO 이벤트의 모든 프라이머에서 예상된 크기의 특이적인 단일 증폭 산물을 확인 할 수 있었고, 대조군 시료로 사용한 다른 이벤트 및 비변형 작물에서는 증폭 산물이 확인되지 않았다(Fig. 6). 대두(A2704-12, MON87705, FG72, MON89788, SYHT0H2) 5종, 옥수수(MON87460, TC1507, MON87411, DAS59122, 98140, MZHG0JG) 6종, 면화(MON531, MON1445, DAS81910, GHB119) 4종, 카놀라(73496, MON88302, Ms11) 3종(Table 7)을 각 primer의 농도와 PCR 조건들을 조절하여 최종적으로 두 종류의 이벤트를 한 번에 검출할 수 있는 동시검출법을 개발한다면, 향후 유전자원이 혼재되어 있을 경우라도 이들 특이 primer를 이용하여 쉽게 구분할 수 있을 것으로 본다.
Fig. 5. Agarose gel and automated capillary electrophoresis system of polymerase chain reaction (PCR) products from event specific. (A) Soybean, (B) maize, (C) cotton, (D) canola. M; 100 bp size ladder. (A) Lane 1 - 7: No etmplate control, non- GM crop, A2704-12, MON87705, FG72, MON89788, SYHT0H2. (B) Lane 1 - 8: No template control, non-GM crop, MON87460, TC1507, MON87411, DAS59122, 98140, MZHG0JG. (C) Lane 1 - 6: No template control, non-GM crop, MON531, MON1445, DAS81910, GHB119. (D) Lane 1 - 5: No template control, non-GM crop, 73496, MON88302, Ms11.
Conclusion
전 세계적으로 LM작물은 재배 면적과 유통량이 매년 증가하고 있으며, 국내에서 LM작물의 재배는 승인된 바 없으나 식품 및 사료 목적으로 수입되는 LM작물의 국내수입량은 꾸준히 증가하는 추세이다. 그래서 상업화 LM작물의 도입 유전물질 정보는 안전성평가의 주요 평가항목이며 LM작물 검정 방법 개발을 위한 기초 정보로 매우 중요하고 국가 간 이동되는 유전자원의 안전성을 확보를 위해 비의도적 혼입 LMO를 신속하게 제거하여 농업유전자원 안전성 확보가 요구되고 있다. 본 연구는 향후 국내 주요 작물들의 재배환경에서 유전자원들의 지속적인 모니터링 체계에 자료로 활용하기 위해 상업화 LM작물들의 유전요소에 대한 정보를 얻고자 국내외에서 승인된 LM작물의 유전자 지도와 유전정보를 조사하였다. LM작물의 유전정보를 수집하여 유전자, 프로모터, 종결부위 등의 유전정보를 분석한 자료를 활용하여 총 18개의 이벤트에 대해 프로모터, 터미네이터 스크리닝과 이벤트 특이적 primer를 이용한 중합효소 연쇄반응을 수행하였다. LM작물의 도입 유전물질 정보는 상업화를 위한 LM작물의 개발과 LM 검정법 개발을 위한 기초 정보로 매우 중요하다. 이에 맞는 새로운 LM 검정법의 개발이 시급히 요구된다. 따라서 본 연구는 국내외 상업화 승인된 LM 작물의 유전자 정보와 제조 방법을 수집/분석하여 LM작물 검정법의 개발과 안전성평가의 기초 자료로 삼고자 하였으며, 수집된 유전정보를 이용하여 실험을 수행한 결과 대두 7종, 옥수수 7종, 면화 7종, 카놀라 8종을 활용함으로서 생산 및 수출하는 농업유전자원의 안전성을 확보 할 수 있을 것으로 사료된다. 또한, event specific 검출을 위해 multiplex PCR방법을 이용하여 국내 LM작물의 검정법을 개발에 활용하고자 하였다. 향후 국내 농업 유전자원들의 LM 여부를 정확하게 분석하여 유전자원들의 보존과 안전성 관리체계를 확보를 위한 LM 유전자 검정 기술로서 효율적인 분석 방법이 될 것으로 사료된다.
Authors Information
Do Yu Kang, National Institute of Agricultural Sciences, researcher
Myung Ho Lim, National Institute of Agricultural Sciences, Agricultural researcher
Soo In Sohn, National Institute of Agricultural Sciences, Agricultural researcher
Hyun Jung Kang, National Institute of Agricultural Sciences, Agricultural research officier
Tae Sung Park, https://orcid.org/0000-0002-9090-5748
