Introduction
발효유의 역사는 아주 오래전부터 시작되어 왔고 현재에도 인류의 건강 증진에 기여도가 매우 큰 식품으로 각광받고 있다. 이러한 이유는 인체에 매우 유익한 유산균과 유산균 배양 중에 형성된 대사산물이 장내 부패균의 성장 저해 작용을 일으키는데 근거를 두고 있다. 유산균 발효유의 건강증진 효과에 대해서는 Metchnikoff (1908)의 불노장수설에서 시작하여 장 운동 조절, 유산균에 의한 장내 균총의 균형 유지에 의한 소화기 건강(Mistuoka, 1990), 병원성 세균의 억제, 소화 흡수의 촉진, 변비, 설사 등의 효과 이외에 영양생리적인 건강증진 작용 또는 항암 기능(Ayebo et al., 1980) 등과 같은 질병 억제 작용에 대한 과학적인 연구가 진행되어왔다.
구기자(Lycium chinense Miller)는 가지과(Solanaceae)의 구기자나무의 열매로 한국을 비롯한 중국, 일본에서 천연약재로 사용되고 있고, 충청남도 청양이 주생산지이다. 구기자는 항산화물질을 함유하고 있고, 항 비만(Hwang et al., 2009), 신장 장애개선(Olatunji et al., 2018) 등의 효과가 있는 것으로 보고되었으며, 구기자의 지표물질 중 하나인 betaine은 간 건강기능 개선, 심혈관 질환 예방 등의 효과(Craig, 2004), 근육의 지구력 향상과 근아세포를 생성시키는 기능(Lee et al., 2021)이 있는 것으로 알려졌다.
또한 홍삼(red ginseng)은 찐 수삼을 건조하여 제조하는 가공품으로 오갈피나무과(Araliaceae), 인삼속(Panax)에 속하는 다년생의 초본류다. 홍삼은 다양한 약리적 효능이 있고 특히 한국에서는 건강기능성 식품으로 매우 인기가 높은 천연약용식물이다. 홍삼은 항산화 기능 외에도 항당뇨(Vuksan et al., 2008), 고지혈증 개선(Kwak et al., 2010) 항암 효과(Shoji, 2001)가 있고, saponin, ginsenoside 같은 지표 물질의 효능도 밝혀졌다(Kenarova et al., 1990; Xie et al., 2005). 본 연구는 한방 생약 소재로 알려진 구기자와 홍삼 그리고 한국인의 주식인 쌀을 첨가하여 제조한 발효유의 생리활성 기능을 밝힘으로써 기능성 요구르트의 연구 및 개발에 기여하기 위해 수행하였다.
Materials and Methods
구기자, 홍삼, 쌀 분말 첨가 요구르트 제조는 Kim 등(2022)의 방법에 따라 수행한 시료를 실험에 사용하였다. 즉 대조구와 쌀분말 4% 첨가구, 구기자추출물 2% + 쌀분말 4% + 홍삼추출물 1% 첨가구(A), 구기자추출물 5% + 쌀분말 4% + 홍삼추출물 1% 첨가구(B)로 구성하여 제조한 요구르트로 실험을 수행하였다.
항산화 효과
DPPH radical scavenging activity
요구르트의 DPPH (1,1-diphenyl1-2-picryhydeazyl, Sigma Aldrich, MO, USA) Radical 소거능 활성 검사는 Blois (1958)의 방법을 응용하여 진행했다. 증류수에 희석한 시료를 0.2 mM DPPH와 혼합하여 96 well plate에 분주한 후 25℃ 암실에서 10분간 반응한 후 microplate reader (Thermo Scientific, MA, USA)를 이용해 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. Blank는 95% ethanol과 50 mg·mL-1의 농도로 희석한 시료를 사용하였고 0.2 mM DPPH와 95% ethanol을 혼합한 것을 대조구로 사용하였다.
RSA: Radical scavenging activity
ABTS radical scavenging activity
ABTS (2,2-anziobis 3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid, Sigma Aldrich., MO, USA) radical 소거능은 Re 등(1999)의 방법을 응용하여 측정하였다. 7 mM ABTS (Sigma Aldrich., MO, USA)를 140 mM K2O8S2 (Sigma Aldrich., MO, USA)와 혼합하여 4℃ 암소에서 12시간동안 보관하여 ABTS stock solution을 제조하였다. 이 후 ABTS stock solution을 potassium persulfate buffer (pH 7.4)에 희석하여 734 nm에서 흡광도가 0.70 ± 0.02인 ABTS working solution을 제조하였다. 이를 50 mg·mL-1로 희석한 시료와 혼합하여 37℃에서 10분간 반응시킨 뒤 microplate reader (Thermo Scientific, MA, USA)를 사용하여 734 nm 흡광도를 측정하여 ABTS radical 소거능을 도출했다. 대조구는 ABTS working solution의 흡광도를 사용했다.
ACE (angiotensin-I converting enzyme) 저해활성
ACE inhibitory activity은 Cushman과 Cheung (1971)의 방법을 응용하여 진행하였다. Rabbit lung acetone powder (Sigma Aldrich, MO, USA) 를 0.3 M NaCl을 함유한 0.1 M sodium borate buffer와 1 : 10으로 혼합한 후 4℃에서 24시간동안 교반 추출하였다. 이를 15,000 × g에서 30분간 원심분리한 후 상징액을 취해 ACE enzyme으로 사용하였다. 기질은 0.3 M NaCl을 함유한 0.1 M Sodium borate buffer에 HHL (hippuryl-histidyl-leucine; Sigma Aldrich, MO, USA)을 5 mM 농도로 희석한 것을 사용하였다. 양성대조군으로는 captopril (Sigma Aldrich, MO USA)을 시료와 같은 농도로 희석하여 사용하였다. 시료 50 μL에 0.1 M Sodium borate buffer 100 μL와 ACE enzyme 50 μL를 첨가한 후 37℃에서 5분간 preincubating한 다음 기질 50 μL를 첨가하여 37℃에서 30분간 반응시켰다. 30분간 반응한 반응액에 0.1 N HCl을 300 μL를 넣어 반응을 정지한 후 ethyl acetate 1 mL를 첨가하고 15초간 교반 한 후 4℃에서 960 × g로 5분간 원심분리 하였다. 원심분리한 상등액을 vaccum concentrator (Hanil, Daejeon, Korea)에 넣어 완전히 건조시킨 후 증류수 1 mL 첨가하여 회수한 뒤 228 nm에서 흡광도를 측정했다. 대조구는 시료대신 증류수를 넣어 진행했다. Sample blank는 ACE-enzyme 첨가 전 0.1 N HCl 300 μL을 넣어 반응을 중지시켜 사용하였다. 저해율은 다음식을 이용하여 구하였다.
Tyrosinase 저해활성
요구르트의 tyrosinase 저해활성을 측정은 Baek (2008)의 방법을 응용하여 측정하였다. 100 mM sodium phosphate buffer (pH 6.5)에 L-tyrosine (Sigma Aldrich, MO, USA)을 녹여 15 mM L-tyrosine 수용액을 제조하여 반응 기질로 사용하였고. 반응 효소로는 mushroom tyrosinase (Sigma Aldrich, MO, USA)를 100 mM의 sodium phosphate buffer에 녹여 2,500 unit·mL-1의 반응효소를 만들었다. 이 후 100 mM sodium phosphate buffer 153 μL에 반응기질 36 μL, 효소액 6 μL, 시료 5 μL을 혼합하여 37℃에서 20분간 반응하였고 96 well을 이용하여 ELISA (Molecular Devices, Emax, CA, USA)를 이용하여 490 nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조구는 시료대신 증류수를 사용하였다. Tyrosinase 활성 저해율은 다음식으로 계산하였다.
OD: Optical density
항염효과
항염효과는 6 well culture dish에 mouse유래 대식세포주 RAW 264.7 세포를 1.0 × 105 cells·welL-1로 분주 후 Dulbecco's modified Eagle medium (Gibco, MA, USA)에 10% (v·v-1) fetal bovine serum (Gibco, MA, USA)과 1% (v·v-1) Penicillin-Streptomycin (Sigma, St. Louis, MO, USA)을 첨가하여 세포를24시간 배양하였다. 발효 48시간째의 대조구와 구기자추출물 5%, 쌀 분말 4%, 홍삼추출물 1% 첨가구의 동결건조물을 200, 1,000 μg·mL-1의 농도로 세포에 처리하고 24시간 배양한 후 배양액에 LPS (lipopolysaccharide; Sigma Aldrich, MO, USA) 1 μg·mL-1을 처리하고 6시간 배양했다. 시료가 첨가된 배지를 제거하고 PBS (phosphate-buffered saline, Gibco, MA, USA)를 이용하여 한번 세척 후 Cube Tissue RNA Mini Kit (PhileKorea, Seoul, Korea)를 이용하여 RNA를 추출하였다. Qubit 2.0 Fluorometer (Invitrogen, MA, USA)로 RNA를 정량후 cDNA를 합성하기 위하여 total RNA 1 μg에 Random Hexamer (100 pmol·μL-1) 1 μL와 dNTP mix (10 mM) 1 μL를 넣은 후 DEPC-treated water로 총 부피 10 μL가 되도록 조정하였다. 65℃에서 5분간 반응시키고, 즉시 얼음에 냉각시킨 다음 RNase inhibitor (Termo Fisher, MA, USA) 1 μL, M-MLV reverse transcriptase (Promega, WI, USA) 1 μL, 5× M-MLV RT reaction buffer 4 μL, DEPC-treated water 4 μL를 추가적으로 첨가하였다. 10분간 실온에서 반응시킨 뒤 1시간 동안 50℃에서 cDNA를 합성하고 합성한 cDNA에 증류수를 넣어 1/5로 희석하였다. 이후 IL (interleukin)-6, IL-1β, TNF (tumor necrosis factor)-α의 mRNA 발현량을 quantitative RT-PCR을 이용해 비교하였다. RT-PCR 수행을 위한 primer는 Table 1과 같다. cDNA 5 μL를 2×Prime Q-mater Mix 10 μL, nuclease free water 2 μL, 10 pmol·μL-1, forward primer 1.5 μL, 10 pmol·μL-1, reverse primer 1.5 μL와 혼합하고 AriaMx를 이용하여 qRT-PCR을 수행하였다.
항균효과
항균효과 검사는 Kirby-bauer disc diffusion 검사법(Jones, 1984)을 응용하여 진행하였다. 실험에 사용한 병원성 미생물은 Pseudomonas aeruginosa (KCT3191), Listeria monocytogenes (KCTC 3443), Salmonella Typhimurium (KCCM 40253)를 LB broth (Difco, NJ, USA)에 3회 계대배양한 후 6,800 × g에서 10분간 원심분리 하여 LB Broth를 회수한 후 멸균된 증류수로 세척하는 과정을 2 - 3차례 반복하여 균주만 회수하였고 이를 다시 멸균수에 희석하여 600 nm에서의 흡광도를 McFarland standard 0.5 (cell density 1×108 CFU·mL-1; BioMérieux, Craponne, France)에 맞춰 희석하였다. 희석된 배양액은 LB agar plate에 100 μL씩 도말한 후 잠시 건조시켰다. 이 후 멸균된 paper disc (Toyo Roshi Kaisha Ltd., Tokyo, Japan)를 적당히 간격을 두고 plate 위에 놓은 후 요구르트의 상등액을 Disc위로 60 μL를 흡수시킨 후 15분간 건조한 다음 60 μL를 다시 흡수시켜 총 120 μL를 흡수시켰다. 이 후 37℃ 배양기에서 72시간동안 배양하고 disc 주변에 생긴 clean zone의 길이(mm)를 측정하였다.
Results and Discussion
항산화 효과
DPPH radical scavenging activity
DPPH radical 소거능의 원리는 짙은 자색을 나타내는 DPPH radical이 항산화 물질과 만나 전자나 수소를 제공받으며 탈색되는 원리로 진행된다(Thongchai et al., 2009). 또한 안정적인 free radical로 항산화 활성 실험에 많이 이용되고 실제로 항산화 활성과도 연관이 있는 것으로 알려져 많이 이용되고 있다(Kim et al., 2008). 구기자와 홍삼, 쌀분말 첨가 요구르트의 DPPH radical 소거능 결과는 Table 2와 같다. 발효 0시간째 대조구는 35.26%, 쌀분말 4% 첨가구는 41.16%, A 첨가구는 70.14%, B 첨가구는 88.71%로 DPPH radical 소거능은 구기자 첨가 함량이 증가할수록 높은 활성을 보였다. 또 모든 처리구는 발효시간이 경과함에 따라서 소거능이 상승하는 경향을 보였는데, 대조구는 48.97%로 상승하였고 쌀분말 4% 첨가구는 49.7%, A 첨가구는 76.27%, B 첨가구는 92.49%로 상승하였다. 이는 구기자와 홍삼에 함유된 phenol성 화합물과 flavonoid의 영향으로 사료된다.
ABTS radical scavenging activity
ABTS radical 소거능은 ABTS가 potassium persulfate와 반응하여 녹색의 ABTS radical을 형성, 생성된 radical을 항산화능을 가진 물질이 전자를 공여하여 무색의 물질로 환원하는 정도를 확인하는 것이다(Kim and Park, 2011). Table 3은 ABTS radical 소거능을 나타낸 것이다. 발효 0시간째 대조구는 55.56%, 쌀분말 4% 첨가구는 56.81%, A 첨가구는 66.81%, B첨가구는 78.61%로 첨가물의 함량에 비례하여 활성이 증가하였다. 또한 발효시간의 경과에 따라서 활성이 증가하였는데, 발효 48시간째 대조구는 59.81%로 증가하였고, 쌀분말 4% 첨가구는 58.10%로 증가하였다. A 첨가구는 70.91%로 상승하였고, B첨가구는 82.91%로 상승하였다.
ACE 저해활성
체내의 RAAS system (renin-angiotensin-aldosterone system)은 혈압이 떨어졌을 때 혈압을 정상화하기 위해서 작동한다. 간에서 생성된 angiotensin-Ⅰ은 ACE에 의해 angiotensin-Ⅱ로 전환되는데 angiotensin-Ⅱ는 혈관 수축과 신장의 aldosterone 분비 증가로 체액의 양을 증가시켜 혈압 상승을 유도한다(Atlas, 2007; Shin et al., 2010). 하지만 체내에 과도한 angiotensin-Ⅱ가 축적되는 경우 체내 혈압이 비정상적으로 증가하는 등의 부작용을 유발할 수 있다. 따라서 angiotensin-Ⅱ를 생성하는 효소인 ACE의 활성을 저해하여 이를 방지할 수 있으며 대표적으로 captopril이 약으로서 사용된다. 요구르트의 ACE 저해활성 결과는 Table 4에 표시했다. 48시간 동안 발효한 요구르트의 ACE 저해활성은 첨가물 함량이 높을수록 상승하였다. 대조구는 63.03% 쌀분말 4% 첨가구는 67.3%, A 첨가구는 74.33%, B 첨가구는 79.7%였다. ACE의 활성을 저해하는 대표적인 물질은 peptide와 페놀성 화합물로 이들은 ACE가 angiotensin-Ⅰ을 분해할 때 비경쟁적으로 작용하며 활성을 저해하는 것으로 알려져 있다(Udenigwe and Mohan, 2014; Kessey et al., 2018). Bae (2005)의 보고에 따르면 구기자 열수추출물첨가 발효유의 ACE 저해활성은 75.67%로 구기자추출물 5%, 쌀 분말 4%, 홍삼추출물 1% 첨가구와 비슷한 경향을 보였다.
Tyrosinase 저해활성
Melanine은 고분자의 천연색소로 동·식물계 전반에 걸쳐서 존재하는 물질로 melanin의 축적은 피부를 어둡게 만드는 대표적인 요인이다. 이러한 melanine의 합성과정에서 작용하는 효소의 활성을 억제하면 melanin의 생성이 방해되며 피부 착색을 예방할 수 있어 여러 차례 보고되었다(Kahn and Andrawis, 1985). Melanine의 생합성 경로는 모두 tyrosine에 적용되는 구리함유 효소인 tyrosinase의 작용으로 생성되는 L-dopaquinone이 효소적 산화과정을 거쳐서 합성이 이루어진다. 이때 melanine 생합성에 관여하는 주요 효소인 tyrosinase의 활성을 저해하여 melanine 생성을 저해할 수 있다(Jung et al., 1995). 요구르트의 tyrosinase 저해활성 실험 결과는 Table 5에 표시했다. 대조구의 활성은 10.55%로 모든 처리구 중 가장 낮았으며 쌀분말 4% 첨가구는 21.7%였다. A 첨가구는 36.21%였고, B 첨가구는 43.49%로 모든 처리구 중 활성도가 가장 높았다. 구기자, 구기엽의 tyrosinase 저해활성에 대해 보고한 Kim 등(2011a)에 따르면 구기자 추출물의 tyrosinase 저해활성은 30.8%였고, 구기엽은 46.2%로 구기자보다 구기엽의 tyrosinase 저해활성이 높다고 보고하였다.
항염효과
염증반응은 상처가 난 부위에서 집중적으로 발생하는 면역 반응으로, 체내 면역관련 세포들, 대식세포, 임파구, 비만세포, 혈소판 등에서 면역에 관련된 많은 인자들이 체내에 유입된 비자기물질을 인식할 경우에 많은 물질들이 분비되며 염증반응을 유발한다. 적당한 면역반응은 체내로 침투된 비자기인자에 대한 방어를 위해 필수적이나, 과도한 cytokine의 분비는 cytokine storm등의 부작용을 유발하여 정상적인 자기를 공격하기도 한다(Fajgenbaum and June, 2020). 따라서 적당한 cytokine의 분비는 중요하며, 항염증 반응에 대한 여러 연구결과가 발표되고 있다(Yoon et al., 2007; Kim et al., 2011b). 염증 cytokine에 대한 항염 효과는 Fig. 1에 나타냈다. TNF-α는 대표적인 염증성 cytokine으로 면역반응, 염증 자극에 의해 활성화된 대식세포에서 생성되어 유리된 후 주위에 자극을 전달하는 cytokine이다. 대조구는 TNF-α의 발현을 억제하지 못했으나 구기자추출물 5%, 쌀분말 4%, 홍삼추출물 1% 첨가구는 TNF-α의 발현을 농도에 비례하여 감소시켰다. IL-6의 발현은 대조구와 구기자추출물 5%, 쌀분말 4%, 홍삼추출물 1%에서 모두 농도의존적으로 감소하였다. 특히 대조구에 비해서 구기자추출물 5%, 쌀분말 4%, 홍삼추출물 1%를 1,000 μg·mL-1으로 처리했을 때 IL-6의 발현이 현저하게 줄어드는 것이 확인되었다. IL-1β은 TNF-α와 마찬가지로 대식세포에서 염증 반응에 의해서 생성되고 유리된 후 주변의 다른 세포에 자극반응을 일으킨다. 대조구와 B 첨가구의 발현량은 유의한 수준의 차이를 보이지는 않았지만 모두 농도의존적으로 발현량이 감소되어 항염 효과를 확인할 수 있었다.
Fig. 1. Anti-inflammatory effect of yogurt with 5% Lycium chinense Mill extract, 1% red ginseng extract and 4% rice powder at the fermentation time of 48 h at 37℃. All values are mean ± SD (standard variation) (p <0.05). C, control; B, yogurt with 5% Lycium chinense Mill. extract + 4% rice powder + 1% red ginseng extract; LPS, lipopolysaccharide; TNF, tumor necrosis factor; IL, interleukin.
항균효과
항균효과는 단백질 복합체, pH 저하, 페놀성 화합물 등에 의해서 발생하는 것으로 알려졌다(Wiegand et al., 2015; Rempe et al., 2017; Mohammadi-Gouraji et al., 2019). 항균효과의 연구를 보면 구기자와 구기자 잎(Mocan et al., 2014), 약용식물 추출물(Park et al., 1992), 커피와 홍삼추출물(Choi et al., 2012), 발효유(Kotz et al., 1990) 등에 관해 여러 연구자들이 보고하였다.
Pseudomonas aeruginosa, Listeria monocytogenes, Salmonella Typhimurium에 대한 항균효과는 Table 6에 나타난 바와 같다. Pseudomonas aeruginosa는 gram 음성의 호기성 간균으로 녹농균으로 알려져 있으며 사람의 피부에서 면역력이 감소한 개체에 폐렴, 비뇨기계 감염 등의 질병을 유발하는 병원성 미생물이다(Seo, 2007). Pseudomonas aeruginosa에 대한 모든 처리구의 항균효과는 발효시간에 따라 증가하였다. 대조구의 항균효과는 발효 전의 clean zone은 0 mm였으나 발효 48시간 경과 후 clean zone은 9 mm로 증가하였다. 쌀분말 4% 첨가구는 2.5 mm에서 8.5 mm로 상승하였고, A 첨가구는 3.5 mm에서 10 mm로 상승하였다. B 첨가구의 경우 4 mm에서 11.5 mm까지 상승하며 첨가물의 함량의 비례하여 증가하는 것을 확인할 수 있었다.
Listeria monocytogenes는 gram양성 간균으로 listeriosis를 유발하며, 폐렴, 심내막염 등의 질병을 유발하고, biofilm을 형성할 수 있어 항균제에 대한 저항이 강한 잠재적 위험을 가진 병원성 미생물로 알려져 있다(Farber and Peterkin, 1991). Listeria monocytogenes에 대한 모든 처리구의 항균효과는 발효시간에 따라 증가하였다. 대조구의 항균효과는 발효 전의 clean zone은 1.5 mm였으나 48시간 발효 후의 clean zone은 9 mm로 증가하였다. 쌀분말 4% 첨가구는 2 mm에서 9 mm로 상승하였고, A 첨가구는 3 mm에서 9.5 mm로 상승하였다. B 첨가구의 경우 4.5 mm에서 10 mm까지 상승하였으나 48시간 발효 후에는 처리 구간의 유의적인 차이는 없었다.
Salmonella Typhimurium는 대표적인 식중독의 원인균으로 알려져 있으며 패혈증, 식중독, 설사 등을 유발하는 균이며(Kim et al., 2008) 발효시간이 경과되면서 모든 처리구의 항균효과는 상승하였다 대조구의 항균효과는 발효 전의 clean zone은 0 mm에서 48시간 발효 후의 clean zone은 9.5 mm로 상승하였고 쌀분말 4% 첨가구는 0.5 mm에서 8 mm로 상승하였다. 또한 A 첨가구는 3 mm에서 9 mm로 상승하였고, B 첨가구는 4 mm에서 10.5 mm까지 상승하였으며 항균효과가 첨가물의 함량에 비례하여 증가하는 것을 확인할 수 있었다.
Conclusion
기능성 식품에 대한 소비자들의 관심이 증가되면서 기존의 발효유에 기능성을 가진 발효유 제품의 개발이 활발하게 이루어지고 있다. 이러한 기능성 요구르트 개발에 기여하고자 한방약재 소재인 구기자와 홍삼 그리고 한국인의 주식인 쌀을 첨가한 요구르트의 생화학적 특성을 연구하였다. 항산화활성, ACE 저해활성, melanin의 합성 저해를 위한 tyrosinase 저해활성은 첨가량이 증가함에 따라 높았다. 염증 cytokine인에 대한 항염효과와 병원성 미생물 3종에 대한 요구르트의 항균효과도 높게 나타났다. 이러한 결과를 바탕으로 구기자와 홍삼, 쌀분말 첨가 요구르트 개발은 기능성 발효유의 가능성을 나타내었고 국민건강에 크게 기여할 것으로 기대한다.
