Introduction
은행나무(Ginkgo biloba)는 대기오염이나 고온건조 등에 저항성이 높으면서 병충해의 발생이 적다. 또한 뿌리가 심근성이라 도로나 인도에 피해가 적어 서울시에서는 가로수로 가장 많이 식재 되어있는 수목이다(Seoul, 2022). 그러나 은행나무는 9월에서 11월 사이 성숙 종자의 자연낙과로 인한 거리오염과 불쾌한 냄새로 민원이 많이 발생하는 대표적 수종이다. 이러한 문제를 해결하기 위해 DNA분석을 활용해 암수나무를 구별하는 기술이 개발되었지만 분석 및 교체비용이 비싸고 식재범위가 넓어 상용화되지 못하고 있다. 이를 해결하기 위해 결실을 막거나, 열매가 성숙되어 악취가 발생되기 전 조기낙과 시키는 방법이 고려되고 있으며, 실제로 조기낙과에 영향을 주는 성분을 포함한 약제가 개발되어 시판되고 있다(Arseneault and Cline, 2017; KoFPI, 2019, 2020).
약제가 토양에 유입되면 pH, 유기물 함량, 무기물 함량 등 토양의 이화학적 특성에 변화를 주고 그 변화에 따라 미생물 군집 또한 변화한다(Deng et al., 2012; Chun et al., 2022). 또한 토양의 이화학적 특성은 식물의 생육에 큰 영향을 주며 토양 미생물의 활력과도 관계가 있다. 따라서, 약제 시비에 따른 은행나무 근권의 미생물 군집과 토양 이화학적 성질의 일시적 또는 영구적 변화는 피할 수 없을 것으로 생각된다. 따라서 토양 미생물 다양성과 이화학적 특성을 분석하는 것은 조기 낙과제의 토양환경에 대한 안전성과 수목에 주는 영향을 평가하는 지표로 활용될 수 있을 것이다(García-García et al., 2019).
근권 미생물의 다양성 분석은 대부분 배양 의존적 방법을 통해 이루어져왔다. 그러나 이 방법은 미생물의 생육에 필요한 조건을 충족시키기 어렵다는 단점이 있으며, 토양 1 g당 존재하는 109 - 1010 이상의 미생물 중 1% 미만의 미생물만을 검출할 수 있다는 단점이 있다(Staley and Konopka, 1985; Kim, 2011) . 최근 유전자 시퀸싱의 효율성을 높인 차세대 염기서열 분석(next-generation sequencing, NGS)기술이 발달하면서, 미생물 동정을 위해 16s rDNA의 서열을 분석하는 방법이 활용되고 있다(Seo et al., 2021). 또한 마이크로바이옴 분석기술의 발달로 미생물의 염기서열을 비교 분석하는 프로그램이 개발되고 있다(Muyzer et al., 1993; Ludwig et al., 1998). 이 중 QIIME2 (Quantitative Insights Into Microbial Ecology 2)에는 DADA2 (The Divisive Amplicon Denoising Algorithm 2), Vsearch, Deblur와 같은 다양한 유전자 분석 옵션이 포함되어 있으며 특히 DADA2는 데이터를 다른 옵션보다 간편하게 denoising하거나 trimming할 수 있다는 장점이 있다(Kuczynski et al., 2012; Callahan et al., 2016).
본 연구에서는 경북대학교 교내(35°53'24.0"N, 128°36'43.2"E)에 식재 되어 있는 은행나무의 근권 토양을 대상으로 차세대 염기서열 분석(NGS)과 QIIME2의 DADA2등을 이용하여 낙과제의 시비에 따른 미생물 군집구성, 미생물 군집 다양성 및 토양 이화학적 특성을 조사하여 은행나무 조기 낙과제의 적용이 은행나무 근권의 토양 생태계에 미치는 영향을 규명하고자 수행하였다.
Materials and Methods
실험목 선정 및 낙과제 처리
본 실험에 사용된 약제는 “㈜에코팜”에서 개발한 천연 유기물을 활용한 은행나무 조기 낙과제인 “하이그로 골드” (Highgro gold, Ecofarm Corp., Gyeongsan, Korea)이며 붕소와 몰리브덴을 유효성분으로 하는 미량요소 복합비료이다. 실험장소는 대구광역시 북구 산격동에 위치한 경북대학교 캠퍼스(35°53'24.0"N, 128°36'43.2"E)이며, 교내에 가로수로 식재되어 있는 직경 25 - 40 cm의 은행나무를 대상으로 낙과제를 처리한 3개체와 대조구로 무처리한 3개체를 각각 3회 채집하여 총 18건의 채집 및 분석을 진행하였다. 약제의 사용에 의한 은행나무의 근권 환경과 미생물 변화를 확인하기 위해 실험 집단을 3월 19일 약제 처리집단(개화 일주일 전)과 3월 26일 처리구(개화 시기), 무처리집단으로 각 3개체씩 나누어 구별하였으며 식재 위치에 따른 영향을 최소화하기 위해 처리 수목과 무처리 수목이 교호배치 되도록 수목을 선정하였다. 낙과제는 원액 250 mL를 토양에 살포하고 1주 간격으로 총 8주 동안 물을 500 mL씩 공급하였다.
은행나무 근권 미생물의 군집 구성 및 다양성 조사
토양 시료의 준비 및 채취
토양시료 채취는 은행나무 근권 0 - 30 cm 깊이의 토양을 세 방향에서 채취하여 섞는 방법으로 3월 19일 낙과제 처리집단 및 무처리집단에 대하여 각 3개체씩 실시하였으며 3월 20일, 4월 24일, 5월 29일에 채집하여 총 18개의 토양 샘플을 분석하였다(Zhang et al., 2017).
DNA 추출 및 라이브러리 제작
채취한 토양 시료는 MP biomeical 사의 Soil SPINeasyDNA kit (MP Bio, CA, USA)를 사용하여 세부 protocol에 따라 토양 내 미생물 DNA 추출을 진행하였다. 추출한 DNA는 –20℃에 저장하였고 추출된 DNA의 라이브러리 제작은 마크로젠(Macrogen, Seoul, Korea)에 의뢰하였다. 세균영역인 16S rRNA의 V3-V4 region과 곰팡이 영역의 ITS2 region을 Illumina Miseq (Illumina®, San Diego, CA, USA)를 사용하여 분석하였다(Wu et al., 2016; Cregger et al., 2018).
메타지노믹 분석
군집분석은 미생물 군집 분석 소프트웨어인 QIIME2 (https://qiime2.org/)를 사용하여 낙과제 처리 및 무처리 은행나무 근권의 미생물 군집 분석을 실시하였으며 연구에 사용된 실험목은 낙과제를 처리한 3개체, 무처리한 3개체로 총 6개체이고 각각 3회 채집하여 총 18건으로 분석을 진행하였다. 퀄리티가 떨어지는 염기서열을 제거하기 위해 DADA2 (https://benjjneb.github.io/dada2/)를 이용하였으며 시퀀싱 과정에서 생긴 잘못된 염기서열인 키메라서열(Chimera)을 제거하였다(Callahan et al., 2016).
데이터의 분류학적 동정은 세균 16S rDNA의 V3-V4 영역에는 classifier 데이터베이스로 silva v138.1 (https://www.arb-silva.de/)을 사용하였으며 곰팡이 ITS2 영역에는 classifier 데이터베이스로 UNITE v8.3 (https://unite.ut.ee/)를 사용하여 동정을 진행하였다(Abarenkov et al., 2010; Robeson et al., 2021).
다양성 분석을 위해 MAFFT v7.4.75 (https://mafft.cbrc.jp/)프로그램과 FastTree (http://www.microbesonline.org/fasttree/)를 이용하여 rooted phylogeny tree와 unrooted phylogeny tree를 생성하고, 알파 다양성 분석 및 베타 다양성 분석을 진행하였다(Katoh et al., 2002). 알파다양성 분석은 Faith’s phylogenetic Kruskal-Wallis (pairwise)를 수행하였으며 베타 다양성은 Bray-curtis법으로 계산하였고, 통계에 의한 차이를 확인하기 위해 PERMANOVA (permutation-based ANOVA)를 수행하였다(Beals, 1984; Faith and Baker, 2006; Anderson, 2014). 모든 분석자료는 R v4.2.1 (https://www.r-project.org/)의 phyloseq, ggplot2 package를 사용하여 시각화 하였다(McMurdie and Holmes, 2013).
은행나무 토양의 이화학적 특성 조사
시기별로 낙과제를 처리한 6개의 토양시료와 3개의 무처리 시료를채취하였으며, 채취시기는 처리 0주차인 3월 20일과 20주차인 8월 5일로하여 총 2회 채취하였다. 분석은 총 18샘플로 진행하였다. 채취한 토양은 5일동안 그늘에서 풍건하고 2 mm의 공극을 가진 체로 쳐서 분리하여 분석에 사용하였다. 분석 항목은 pH, 유기물, 유효인산, 치환성양이온, 전기전도도, 붕소, 몰리브덴을 포함한 총 7개 항목에서 토양 이화학적 특성 분석을 실시하였으며, 분석방법은 농촌진흥청 국립농업과학원에 의뢰하여 토양화학분석법(Kim et al., 2010)을 토대로 진행하였고 변화량을 SPSS v26.0 (IBM Corp., NY, USA)를 사용하여 독립표본 T-검정을 진행하였다.
Results and Discussion
은행나무 근권 미생물 군집 구성
세균 군집은 총 337,603 reads가 분석에 사용되었으며 대표적으로 Proteobacteria 문이 가장 우점하였고, Actinobacteria, Chloroflexi가 다음으로 우점하는 등, 문(Phylum) 수준에서는 총 15개의 문을 확인할 수 있었다. 곰팡이 군집에서는 총 2,855,366 reads가 분석에 사용되어 Ascomycota 문이 가장 우점하였으며, 다음으로 Basidiomycota, Glomeromycota 문이 우점하는 형태로 문(Phylum) 수준에서는 총 11개의 문을 확인할 수 있었다. 처리군 9개와 대조군 9개의 샘플 분석결과 박테리아 군집에서는 상위 5개의 우점종의 분포에서 모두 유의한 차이(p < 0.05)를 보였으며(Fig. 1A) 곰팡이 군집에서는 상위 5개의 우점종 중에서 Glomeromycota의 분포가 유의적 차이를 보이는 것으로 확인되었다(Fig. 1B).
은행나무 근권 미생물의 알파 다양성 분석
18개 샘플의 Kruskal-Wallis (pairwise)를 사용한 박테리아 군집의 알파다양성 분석에서는 3월 20일을 제외한 모든 기간에서 처리군의 faith_pd값이 더 높은 것으로 나타났다. 3월 20일에는 처리군 및 무처리군의 p-value값은 0.51로 유의수준(p < 0.05)보다 높아 시료 간에 종 다양성에 차이가 없는 것으로 나타났지만 4월 24일에는 p-value값이 0.049로 유의수준(p < 0.05)보다 낮았으며 처리군에서 더 높은 미생물 다양성을 가진 것을 확인할 수 있었다. 또한 5월 29일에는 p-value값이 0.13으로 유의수준(p < 0.05) 보다 다시 높아져 통계적 차이를 보이지 않는 것으로 보아 미생물 군집의 차이가 시간의 지남에 따라 회복된 것으로 판단된다. 모든 기간을 종합한 알파 다양성 분석에서는 p-value값이 0.02으로 유의수준(p< 0.05)보다 낮아 적과제를 처리한 집단의 미생물 다양성이 높은 것을 확인할 수 있었다(Fig. 2). 곰팡이 군집의 Kruskal-Wallis (pairwise) 분석 결과에서는 모든 기간에서 처리군의 faith_pd값이 높게 나왔지만 p-value가 유의수준(p < 0.05)보다 높은 것으로 나타나 다양성의 차이가 없는 것으로 나타났다. 따라서 낙과제의 적용은 곰팡이 군집 알파다양성에는 유의미한 영향을 주지 않는다는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 2).
은행나무 근권 미생물의 베타 다양성 분석
18개 샘플의 박테리아 군집의 Bray-Curtis 기법을 기반한 베타 다양성 분석과 PERMANOVA분석 결과 p-value가 유의수준(p < 0.05)보다 낮은 0.011으로 처리군과 미처리군의 집단에서 유의한 차이를 가진 것으로 나타났으며 PCoA분석을 통해 공간상으로 처리군과 무처리군 간에 미생물 군집 유사도에서 확실한 차이를 확인할 수 있었다(Fig. 3).
곰팡이 군집 베타 다양성 분석에서도 p-value값이 0.001로 유의수준(p < 0.05) 보다 낮아 처리군과 미처리군의 군집 간에 유의한 차이를 가진 것으로 나타났으며 PCoA분석을 통해 공간상으로 처리군과 무처리군의 군집 유사도의 차이를 확실하게 확인할 수 있었다(Fig. 3).
은행나무 근권 토양의 이화학적 특성 조사
은행나무 근권 토양의 이화학적 특성 조사 결과, 처리군과 무처리군에서 pH, 유기물, 치환성 K 함량이 0주차에 비해 20주차에서 모두 감소한 것으로 측정되었으며 전기전도도, 치환성 Ca, 붕소함량은 0주차에 비해 20주차에서 처리군 및 무처리군에서 모두 증가한 것으로 측정되었지만 처리군과 무처리군 간의 통계적인 유의성은 없었다. 반면 마그네슘의 경우에는 처리군에서는 증가하였으나 무처리군에서는 감소하였으며 통계적인 유의성은 없었고 반대로 유효인산은 처리군에서 감소하였으나 무처리군에서 증가하여 평균값이 32.03 mg·kg-1차이를 크게 보였지만 통계적인 유의성은 없었다. 몰리브덴 함량은 처리군에서는 측정되었지만 무처리군에서는 측정되지 않아 지속적인 반복실험에 따른 차이를 검증할 필요가 있는 것으로 사료된다(Table 1).
Conclusion
본 연구는 붕소와 몰리브덴을 유효성분으로 하는 은행나무 조기 낙과제가 은행나무 근권에 미치는 영향을 분석하였다. 알파 다양성은 샘플 내 다양성을 의미하고, 베타 다양성은 샘플 간의 다양성을 의미한다. 알파 다양성 분석 결과 곰팡이 군집에서는 처리구와 대조구의 다양성에 유의한 차이가 없었지만 박테리아 군집에서 처리군과 무처리군 간의 미생물 군집 다양성 수준에 유의한 차이가 나타났다. 미생물 군집은 토양의 성분변화에 따라 변화된다고 보고되고 있다(de Gannes et al., 2015). 따라서 천연성분에서 유래한 낙과제의 성분에 포함되어 있는 양분이 토양으로 유입되어 박테리아 군집의 미생물의 다양성이 상승한 것으로 판단된다. 또한 4월 24일에는 크게 차이가 났지만 시간이 지남에 따라 토양이 안정되고 5월 29일에는 박테리아의 다양성 수준이 회복되는 경향을 보였으며 토양 이화학적 특성 조사 결과에서도 8개의 항목(pH, 유기물, 치환성 K, 전기전도도, 붕소, 치환성 Mg, 유효인산, 몰리브덴)에서 낙과제 처리 0주차와 20주차의 변화에 유의적인 차이가 없었으므로 토양에 영구적인 영향을 주지는 않는 것으로 판단된다. 하지만 베타 다양성 분석에서 보여 주듯이 처리군과 미처리군 간의 미생물 군집 구조에는 명확한 차이가 있으며 처리군에서만 몰리브덴이 검출되었다. 식물에서는 몰리브덴 과다는 비교적 위험하지 않지만 고농도에서는 잎의 변색이나 황백화가 발생할 수 있다는 보고가 있다(Kaiser et al., 2005). 따라서 장기적인 관점에서 일시적인 토양환경의 교란이 반복되면 은행나무의 생육과 근권 미생물 군집에 줄 수 있는 영향에 대해서는 추가적인 연구가 필요한 것으로 사료된다. 또한 본 연구를 통해 토양 메타게놈 분석이 토양 건강 및 변화의 지표로 사용될 수 있음을 시사하였다.
Acknowledgements
본 연구는 산림청(한국임업진흥원) 산림과학기술 연구개발사업(FTIS 2019149C10-2323-0301 및 FTIS 2021299D10-2121-AD02)의 지원에 의해 수행되었습니다.
Authors Information
Seok Hui Lee, https://orcid.org/0000-0002-2209-1500
Jong-Beom Seo, https://orcid.org/0000-0001-6863-5983
Jun Young Park, https://orcid.org/0000-0003-4655-3092
Ah Hyeon Choi, https://orcid.org/0000-0002-5114-5512
Dae Sol Kim, https://orcid.org/0000-0002-7137-3133
Do Yeon Kim, https://orcid.org/0000-0002-1407-5949
Su Hong Jeon, https://orcid.org/0000-0002-6668-8632
Hee Min Lim, https://orcid.org/0000-0002-9197-1560
Woo Jin Park, https://orcid.org/0000 0002 3511 2585
Sin Young Park, https://orcid.org/0000-0002-3443-3379
Sang Jun Park, Department of Forestry, Kyungpook National University, professor
Seong-Ho Kim, Jinyangsa Corp., CEO
Jae Doo Jo, Ecofarm Corp., CEO
Jun Won Kang, https://orcid.org/0000-0003-3641-4654
