Introduction
칼라(Zantedeschia spp.)는 열대성 구근작물로 천남성과에 속하는 단자엽이다. 칼라는 원예학적으로 2개의 그룹으로 분류되며 습지생육형 백색칼라, 건지생육형 유색칼라가 있다. 백색칼라는 겨울철에 잎이 죽지 않고 늦가을부터 봄까지 꽃이 피는 에티오피카(Z. aetiopica)종이다. 자생지는 서늘한 기후조건으로 겨울평균 12 - 14℃, 최저기온이 5℃이며 비가 주로 오는 곳이다. 화포가 유색인 유색칼라는 주로 여름철에 꽃이 피는 레마흐니(Z. rehmannii)종, 엘리오티아나(Z. elliottiana)종, 펜트랜디(Z. pentlandii)종, 쥬쿤다(Z. juncund)종, 알보마큘라타(Z. albomaculata)종이 있다. 자생지가 여름 우기의 서늘한 기후대에 분포하고 여름평균 20℃, 최고기온이 27℃이다(Singh et al., 1996; Choi et al., 1998). 백색칼라는 1912년 국내 도입되어 1980년대 중반부터 농가에서 재배되기 시작하였다(RDA, 2018). 재배면적은 2017년부터 7 - 9 ha로 재배면적이 유지되고 있다(MAFRA, 2021). 칼라 구근은 습한 기후를 좋아하기 때문에 곰팡이와 세균의 공격을 받기 쉬우며, 특히 무름병(soft rot) 병균인 Erwinia carotovora subsp. carotovoras는 개화 전에 급격히 확산하고 심하면 구근까지 부패된다(Hyang et al., 2015a; 2015b; Nam et al 2016; Seo et al., 2021). 국립원예특작과학원은 2008년 Silky White 품종 개발을 시작으로 2022년까지 총 11품종의 백색칼라를 개발하였다. 개발된 품종은 대부분 무름병 저항성이 중도이상으로 무름병에 강하며, 구근번식력이 높은 것이 특징이다(NIHHS, 2018).
식물에 널리 분포하는 페놀화합물은 대표적인 생리활성 물질로 다양한 질병을 예방하며 특히, 항산화 작용에 중요한 역할을 한다(Ares et al., 2009; Mugisha et al., 2016). 합성항산화제는 대표적으로 butylated hydroxytoluene (BHT), butylated hydroxyanisole (BHA)가 있으며, 이는 주로 식품첨가물로 이용되고 있으나, 과량 이용 시 암을 촉진한다는 보고가 있다(Suh and Choi, 2010). 따라서, 안정성이 보장된 천연 항산화제 개발 요구가 증가되고 있다. 화훼류에서는 장미, 구절초, 해당화 등 다양한 꽃의 항산화 활성이 보고되었다(Hyun et al., 2011; Kim et al., 2018; Jo et al., 2021).
백색 칼라는 유전자 EST-SSR 마커(Chen et al., 2005; Wei et al., 2012) 등 유전자 분석 연구는 보고된 바 있으나, 품종 간의 특성 비교, 성분 및 항산화에 대한 연구가 전혀 보고되어 있지 않았다. 따라서 우리는 국내에서 개발된 11품종 백색 칼라의 생육 특성과 부위(꽃, 잎)를 이용하여 항산화 활성 및 총 페놀 함량에 관한 연구를 수행하였다. 이는 새로운 품종 육성 및 기능성 원료 가능성을 제시하기 위한 기초자료로 활용될 수 있을 것이다.
Materials and Methods
재배
칼라 구근은 2019년부터 2021년까지 3년동안 재배하여 농사시험연구조사기준(RDA, 2012)에 따라 초장, 화폭 등 생육 특성을 조사하였다. 수확 구근은 큐어링 단계를 거쳐 3개월간 10℃에서 휴면타파를 하였다. 이후 구근은 9월말에 농촌진흥청 표준영농재배법(RDA, 1996)에 준하여 가온 하우스에서 구근상자를 이용하여 정식하고 재배하였다. 정식 후에는 식물체가 자라는데 지장이 없도록 충분히 관주 하였고, 7 - 10일 간격으로 지속적으로 관주 하였다.
추출물 제조
실험에 사용된 백색칼라 시료는 2021년 국립원예특작과학원에서 재배하여 꽃과 잎을 동결 건조하여 분말화하였다. 건조된 꽃과 잎을 10 g을 70% 에탄올로 실온에서 24 시간 동안 추출하였다(시료/용매 비율, 1 : 10). 여과 후, 추출물을 vacuum evaporator (Ratavapor R-121, Buchi, Flawil, Switzerland)로 감압농축하고 동결 건조시킨 후 -80℃에 저장하여 실험에 사용하였다.
2,2’-azinobis (3-ethylbebzothiazoloine-6-sulfonic acid)-diammounium salt (ABTS+) radical scavenging 측정
ABTS+ radical scavenging 측정하기 위하여 ABTS tablet (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)을 7 mM 농도로 H2O에 용해시킨 후 2.45 mM potassium peroxodisulfate (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) 와 1 : 1 비율로 혼합시켜 16시간 상온에 둔 후 사용하였다. 에탄올에 녹인 시료 20 μL와 ABTS 용액 180 μL를 섞어 실온으로 암실에서 30분간 반응시켰다. 흡광도는 734 nm에서 multi-plate reader를 사용하여 측정하였다(Soundharrajan et al., 2014). ABTS+ 라디칼 소거활성은 다음과 같이 계산한 후(% inhibition = [control – sample]/control), 라디칼을 50% 저해하는 농도 값인 IC50값을 사용하여 나타내었다.
1,1-diphenyl-2-picrrylhydrazyl (DPPH) radical scavenging 측정
DPPH free radical scavenging 측정하기 위해 DPPH를 0.2 mM로 에탄올에 용해시켜 DPPH 용액을 제조하였다. 에탄올에 녹인 시료 50 μL와 0.2 mM DPPH 용액 200 μL를 섞어 암실에서 30분간 유지시킨 후 517 nm에서 multi-plate reader를 사용하여 측정하였다(Ko et al., 2012). DPPH 라디칼 소거능의 비율은 다음과 같이 계산한 후(% inhibition = [control - sample]/control), 라디칼을 50% 저해하는 농도 값인 IC50값을 사용하여 나타내었다.
총 페놀함량 및 총 플라보노이드 측정
총 페놀함량은 Folin-Dennis법을 이용하였다(Folin and Denis, 1912). 각 시료 25 μL 추출물과 2 N Folin-Ciocalteu 시약 25 μL와 6분간 반응 후 7.5% sodium carbonate anhydrous 용액 100 μL를 넣고 90분 동안 상온에서 암반응시켰다. 흡광도는 multi-plate reader (Biotek, Vermont, USA)를 사용하여 765 nm에서 측정하였으며 기준물질로는 gallic acid (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)을 사용하였다.
총 플라보노이드 함량은 각 시료 25 μL 추출물과 50 g·L-1 NaNO2 시약 10 μL를 5분간 반응 후 100 g·L-1 AlCl3를 15 μL 넣고 상온에서 반응시킨다. 6분뒤 0.5 M NaOH 50 μL를 넣은 후 multi-plate reader (Biotek, Vermont, USA)를 사용하여 흡광도 765 nm에서 측정하였으며 기준물질로는 catechin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)을 사용하였다.
통계 처리
통계 분석은 SPSS 통계프로그램(Statistical Package for the Social Science, Ver. 12.0, SPSS Inc., Chicago, IL, USA)을 사용하여 사후검증을 실시하였다. 특성 실험군은 3회, 항산화 및 함량은 9회 반복 실시하였으며, 평균(mean) ± 표준편차(standard deviation, SD)로 표기하였다. 각 처리군 간의 평균과 표준편차를 산출하여 Duncan’s multiple range test로 유의성을 검정(p < 0.05)하였다. 이후 상관관계는 Pearson’s correlation analysis를 이용해 분석(p < 0.05, p < 0.01)하였다.
Results and Discussion
국내 육성 백색칼라 생육 특성 평가
국립원예특작과학원에서 육성한 백색칼라의 품종별 차이를 알아보기 위해서 생육 특성을 평가하였다(Fig. 1). 개발된 11품종 백색칼라는 구근 정식 후부터 개화 소요일이 평균 143.02 ± 18.14일이었다. 개화소요기가 130일 이전은 조생종, 130 - 150일은 중생종, 150일 이상은 만생종으로 구분하며 조생종으로는 ’Silky White’, ʻWhite Heart’ (Hyang et al., 2015b), ʻWhite Ring’, ʻBlanco’, ʻSwan’ (Seo et al., 2021), 중생종은 ʻMont Blanc’, ʻWhite Cutie’ (Hyang et al., 2015a), ʻWhite Egg’, 만생종은 ʻPure Love’, ʻCotton Candy’, ʻSaeha’이다. 백색칼라의 평균 63.80 ± 5.44 cm로 초장이 가장 큰 품종은 72.00 ± 3.46 cm ʻWhite Cutie’이고 작은 품종은 ʻPure Love’과 ʻWhite Egg’로 54.33 ± 6.49 cm, 54.00 ± 3.51 cm로 그 외 품종은 초장은 평균과 비슷하다. 화포의 길이는 평균 11.8 ± 1.11 cm, 화포의 폭은 평균 9.40 ± 1.63 cm으로 ʻWhite Heart’, ʻWhite Ring’, ʻCotton Candy’는 화폭이 10 cm 미만으로 꽃이 작고 ʻWhite Egg’, ʻWhite Cutie’의 화폭이 14 cm 정도로 다른 품종보다 크다. 평균 엽장은 33.7 ± 3.48 cm, 엽폭은 평균 20.0 ± 1.38 cm으로 가장 큰 잎을 가진 품종은 ʻMont Blanc’이었고 가장 작은 잎은 ʻWhite Ring’이었다(Table 1). 백색칼라는 품종 간의 생육 특성의 차이가 있으므로 재배 및 새로운 품종으로 육성하는데 유용한 유전자원으로서 활용가능성이 있다고 생각된다.
백색칼라 품종의 부위별 ABTS+ 및 DPPH radical scavenging 활성
항산화 활성을 측정하는 방법은 대표적으로 ABTS+ 과 DPPH radical scavenging 활성법을 이용하고 그 결과는 서로 약간의 차이가 있다. 비교적 안정한 radical인 ABTS+ radical scavenging은 양이온 radical을 생성하고 DPPH radical scavenging은 음이온 라디칼을 생성하는 차이가 있어 상이한 결과 값이 나올 수 있다고 알려져 있다(Lee et al., 2012; Kwak and Choi, 2015). ABTS+ radical scavenging 활성은 potassium persulfate와 반응에 의해 생성된 ABTS+ radical이 항산화 성분에 의해 소거되는 원리(Re et al., 1999)를 이용해서 백색칼라 꽃과 잎 추출물의 항산화 활성을 평가하였다(Fig. 2A and B). ABTS+ radical scavenging 활성 결과는 Fig. 1A, B와 같이 IC50값으로 비교하여 분석하였다. 꽃은 ʻWhite Egg’가 71.71 ± 4.45 µg·mL-1로 가장 높은 항산화 활성이 나타났다. 그리고 ʻSilky White’ (IC50 73.09 ± 5.69 µg·mL-1), ʻSwan’ (IC50 78.50 ± 10.64 µg·mL-1) ʻWhite Cutie’ (IC50 78.97 ± 3.82 µg·mL-1) 순으로 높은 항산화 활성을 확인하였다(Fig. 2A). 잎에서는 ʻWhite Egg’가 240.21 ± 4.45 µg·mL-1, ʻCotton Candy’ 240.90 ± 14.79 µg·mL-1가 IC50값이 낮게 나타나 항산화 활성이 높을 것을 확인하였다(Fig. 2B). 꽃과 잎을 비교해 보면 꽃이 잎보다 높은 ABTS+ radical scavenging 활성이 높은 것을 확인하였고, 품종은 ʻWhite Egg’이 부위에 관계없이 높은 활성이 나타났다. DPPH radical scavenging 활성은 식물에서 추출한 화합물의 항산화력을 측정하는 가장 대표적인 방법으로 hyrodrazyl의 질소원자가 불안정한 상태일 때 수소원자를 받아들이기 쉬운 상태로 항산화 물질과 반응하는 방법을 이용한 측정법이다(Bondet et al., 1997). DPPH radical scavenging는 자유 라디칼인 DPPH 시약으로 시료의 항산화 능력을 이용하여 측정하였다(Fig. 2C and D). ABTS+ radical scavenging활성과 DPPH radical scavenging과 유사한 경향을 보였으며, 꽃의 IC50값은 ʻSwan’ 43.14 ± 5.20 µg·mL-1, ʻSilky White’ 48.25 ± 8.34 µg·mL-1, ʻWhite Egg’ 47.52 ± 5.76 µg·mL-1 가 항산화 활성이 높았다(Fig. 2C). 또한 잎의 IC50값은 ʻSaeha’ 161.92 ± 6.24 µg·mL-1, ʻWhite Egg’ 178.87 ± 9.11 µg·mL-1로 항산화 활성이 높은 것으로 나타났다. 부위별로는 꽃이 잎보다 DPPH radical scavenging 활성이 높았고 품종별로는 꽃은 ʻSwan’, 잎은 ʻSaeha’이 활성이 높았다. 백색칼라 항산화 활성 결과, 꽃과 잎이 모두 활성이 높은 품종은 ʻWhite Egg’로 확인되었다. 이 결과는 백색칼라 ʻWhite Egg’ 품종이 국내에서 육성한 식용이 가능 장미 중 항산화 활성이 높은 러버샤이 품종이 ABTS+ 및 DPPH 라디칼 소거 활성이 각각 428.10 및 419.59 mg AAE/extract g (Jo et al., 2021)이고, 진달래 꽃이 257 mg·mL-1 (Lee et al., 2007) 보다 높은 활성을 가지고 있었다.
백색칼라 품종의 부위별 총 폴리페놀 및 플라보노이드 함량 비교
백색칼라 품종의 꽃과 잎에 함유된 총 폴리페놀 양은 gallic acid, 총 플라보노이드는 catechin 함량으로 환산하여 표시하였다(Table 2). 식물계의 페놀성 화합물은 약 8,000여종 이상 알려져 있으며, 항산화, 항암 등 다양한 기능성이 보고되고 있다(Aruona, 2003; Soobrattee et al., 2005; Bertoncelj et al., 2007). 총 폴리페놀 함량이 꽃에서는 ʻSwan’과 ʻWhite Egg’가 370.55 ± 4.15 mg GAE·g-1, 366.21 ± 13.58 mg GAE·g-1으로 잎은 ʻPure Love’ 216.59 ± 19.80 mg GAE·g-1, ʻWhite Egg’ 210.82 ± 0.93 mg GAE·g-1 가 가장 높았다. ʻMont Blanc’ 이 꽃은 219.82 ± 34.11 mg GAE·g-1, 잎은 165.13 ± 0.39 mg GAE·g-1 로 총 폴리페놀 함량이 가장 낮았다. 총 플라보노이드는 ʻWhite Egg’과 ʻSilky White’가 꽃에서 352.65 ± 6.25 mg CAE·g-1, 341.46 ± 20.67 mg CAE·g-1, 잎에서는 229.73 ± 2.40 mg CAE·g-1, 216.61 ± 32.26 mg CAE·g-1로 11품종 중에서 가장 높은 함량은 가지고 있었다. ʻWhite Heart’가 173.69 ± 7.60 mg CAE·g-1, 113.48 ± 5.56 mg CAE·g-1으로 총 프라보노이드 함량이 가장 낮았다. 부위별 함량분석에서는 꽃의 총 폴리페놀과 총 플라보노이드 함량이 높은 것으로 확인되었으며, 품종 간에는 ʻWhite Egg’가 부위에 관계없이 높은 함량은 가지고 있었다. 본 실험에 사용된 백색칼라 품종은 복숭아 꽃의 총 페놀화합물 함량과 총 플라보노이드 함량은 각각 78.1 mg·g-1과 55.3 mg·g-1 (Kwak and Choi, 2015), 백목련의 총 페놀함량이 72.6 - 118.0 mg·kg-1, 매화 (53.2 - 83.8 mg·kg-1)와 홍화(29.3 - 42.5 mg·kg-1) (Lee et al., 2014), 진달래는 209.1 mg GAE·g-1 (Lee et al., 2007)와 비교해 볼 때 높은 수치임을 알 수 있다. 또한, 국내 육성 식용이 가능한 21 가지 장미 품종의 총 폴리페놀 및 총 플라보노이드 함량이 379.70 - 130.23 mg GAE·g-1, 50.10 - 9.46 mg CAE·g-1 (Jo et al., 2021)보다 높은 함량을 나타내었다. 총 폴리페놀 및 총 플라보노이드 함량과 ABTS+ 및 DPPH radical scavenging이 유사한 경향을 보였는데, Wong과 Kitts (2006)의 보고에서 식물에 존재하는 항산화 활성은 페놀성 화합물의 함량과 높은 연관성을 가진다는 결과와 일치하는 경향이었다.
Fig. 2
Anti-oxidative activities of calla cultivars extract by 70% ethanol (Silky White, Mont Blanc, White Cutie, White Egg, White Heart, Pure Love, White Ring, Blanco, Swan, Cotton Candy, Saeha). Results were expressed the radical activities measurement as IC50 values (μg·mL-1). A, flower of ABTS+ IC50 values (μg·mL-1); B, leaves of ABTS+ IC50 values (μg·mL-1); C, flower of DPPH IC50 values (μg·mL-1); D, IC50 leaves DPPH values (μg·mL-1). Error bar are mean ± standard deviation (SD) (N = 9). a - d: Values with different letters within the same column differ significantly (p < 0.05) through one-way ANOVA followed by Duncan's multiple range test, 5% level. ABTS+, 2,2’-azinobis (3-ethylbebzothiazoloine-6sulfonic acid)-diammounium salt radical scavenging activity; DPPH, 1,1-diphenyl-2-picrrylhydrazyl radical scavenging activity; N.D., non-detection.
생육 특성, 유용 성분과 항산화 활성 간의 상관관계
백색칼라의 생육 특성 항목, 항산화 활성과 총 폴리페놀의 상관관계를 알아보기 위하여 Pearson’s correlation coefficient 분석을 시행하였으며 그 결과는 Table 3과 같다. 개화일수는 화포길이(r = 0.366, p > 0.05), 화포 폭(r = 0.434, p > 0.05)와 양의 상관관계를 나타내었다. 초장은 화포의 길이(r = 0.711, p > 0.01)와 높은 양의 상관관계를 나타났다. 또한, 꽃포개짐높이(r = 0.347, p > 0.05), 잎 길이(r = 0.398, p > 0.05), 잎 넓이(r = 0.352, p > 0.05), 화포의 길이(r = 0.351, p > 0.05)가 양의 상관관계를 나타났다. 화포 길이는 잎 길이(r = 0.495, p > 0.01), 꽃 포개짐은 잎의 길이(r = 0.580, p > 0.01), 넓이(r = 0.569)와 높은 양의 상관관계를 보였다. 생육 특성과 유효성분, 항산화 활성의 상관관계를 확인한 결과, 개화일수가 꽃의 ABTS+ radical scavenging (r = 0.364, p > 0.05)와 양의 상관관계를 가지며, 총 페놀(r = -0.393, p > 0.05), 총 플라보노이드(r = 0.513, p > 0.01)는 음의 상관관계를 가졌다. 잎 넓이는 꽃의 DPPH radical scavenging (r = 0.349, p > 0.05), 잎의 총 플라보노이드(r = 0.370, p > 0.05)과 양의 상관관계를 가지며 꽃의 총 페놀(r = -0.363, p > 0.05)은 음의 상관관계가 있었다. 잎의 총 플라보노이드 함량은 꽃포개짐(r = 0.361, p > 0.05), 잎길이(r = 0.363, p > 0.05), 넓이(r = 0.370, p > 0.05)와 양의 상관관계가 나타났다. 이는 재배 시 개화일수와 잎 넓이를 통해서 꽃의 유효 성분과 항산화활성을 유추할 수 있으며, 품종 개발 시에는 개화 일수가 길고, 잎이 넓은 품종을 이용하여 교배한다면 항산화 활성이 높은 실생을 얻을 수 있을 것이다. 꽃의 유효 성분과 항산화 활성의 상관관계에서는 ABTS+ radical scavenging는 DPPH radical scavenging (r = 0.676, p > 0.01)과 높은 양의 상관관계이며, 총 페놀(r = -0.886, p > 0.01)과 총 플라보노이드(r = -0.371, p > 0.05)는 음의 상관관계를 나타냈다. DPPH radical scavenging는 총 페놀(r = -0.853, p > 0.01), 총 플라보노이드(r = -0.542, p > 0.01)와 높은 상관관계를 나타났다. 잎에서는 ABTS+ radical scavenging가 DPPH radical scavenging (r = 0.600, p > 0.01)으로 높은 양의 상관관계이며, DPPH radical scavenging는 총 페놀(r = -0.486, p > 0.01)과 높은 음의 상관관계를 나타냈다. 항산화 활성은 페놀과 플라보노이드 등 기능성 물질 함량과 밀접한 상관관계를 보인 것으로 알 수 있있다. DPPH radical scavenging는 총 플라보노이드 함량과 상관관계를 찾기 어려운 것으로 나타났는데, 이는 폴리페놀 화합물의 종류 및 성분에 따라 항산화 활성의 차이가 있다는 기존의 연구결과(Kang et al., 1996; Zhou and Yu, 2006; Kim et al., 2012; Lee et al., 2019)와 일치하였다.
Conclusion
본 연구는 국립원예특작과학원에서 육성된 백색칼라 11 품종의 생육특성과 항산화 성분 및 활성평가를 통하여 국내육성품종의 이용 방안을 모색하고자 수행하였다. 백색칼라 품종의 초장은 비슷하였지만, 개화기와 화폭의 크기에 따라 품종의 특성을 구분할 수 있었다. 부위별(꽃, 잎)시험 시, 총 폴리페놀 함량과 항산화 활성은 잎에 비에 꽃이 우수하였고 품종에서는 ʻWhite Egg’가 항산화 활성이 높았으며 유효성분인 총 페놀과 총 플라보노이드의 함량이 많았다. 그리고 개화기가 길수록 잎 넓이가 클수록 꽃의 항산화 활성과 유효성분의 함량이 낮은 것으로 확인되어, 항산화 활성의 특성을 목적으로 육종 및 재배하는 경우 유용할 것으로 보여진다. 이러한 결과는 백색칼라의 생육 특성을 비교와 기능성 물질 함량이 높고 항산화활성이 우수한 품종을 선발할 수 있었다. 현재 절화용으로만 재배되는 백색 칼라가 천연 항산화 소재로 개발될 가능성이 있음을 제시하고 있다.
Authors Information
Kyung Hye Seo, https://orcid.org/0000-0002-8155-8051
Myung Suk Ahn, https://orcid.org/0000-0003-3886-3381
Ji Hun Yi, https://orcid.org/0000-0003-0197-6438
Young Ran Lee, https://orcid.org/0000-0003-0197-6438
Yun-Im Kang, https://orcid.org/0000-0002-5759-065X
Youn Jung Choi, https://orcid.org/0000-0003-2590-4690
Jung Nam Suh, https://orcid.org/0000-0002-6191-8400
Hye Sook Jang, https://orcid.org/0000-0002-4609-9582
