Introduction
유산소 호흡을 하는 거의 모든 생물체의 세포에서 발생 reactive oxygen species (ROS)는 생체물질의 자가 산화, 방사선, 화학물질에 의한 외부자극에 의해 생성될 수 있는 것으로 알려져 있다(Fridovich, 1978; Kodama, 1988). 이러한 활성산소의 종류로는 superoxide anion (O2-), hydrogen peroxide (H2O2), singlet oxygen (1O2), hydroxyl radical (·OH), peroxyl radical (RO·) 등이 있다. 이
들 활성산소는 여러 가지 환경적 요인이나 병리적인 요인들에 의하여 과잉으로 생성될 수 있으며 이들의 과다 생성과 활성산소를 제거하고 방어하는 항산화 방어체계의 결핍은 항산화 방어체계간의 불균형을 일으켜, 산화적 스트레스를 발생시킨다(Cadenas and Davies, 2000; Bokov, 2004). 또한 산화적 스트레스의 증가는 암과 심혈관 질환 및 알츠하이머와 같은 만성 질환의 병리학적 진행과 노화과정의 중요한 원인이 되는 것으로 알려져 있다(Cavalca et al., 2001; Gibson and Huang, 2005).
연꽃(Nelumbo nucifera Gaertner)은 수련과(Nymphaeaceae)에 속하는 여러해살이풀로 연못이나 늪에서 자란다. 물 속 땅에서 옆으로 길게 뻗어 자라는 원통모양의 뿌리줄기는 연근이라고 하여 식용으로 사용되며 연잎은 차나 연잎밥 등으로 이용되고 있다. 연자육은 연꽃의 잘 익은 종자를 가을에 수확하여 과피를 제거하여 말린 것으로 연밥 혹은 연자로 불리며, 예부터 한방 및 민간에서 약재 혹은 식용으로 널리 사용되어져 왔다. 연자육은 한방에서 주로 지혈, 어혈제거, 해혈, 토혈, 혈뇨, 혈변을 치료하는데 사용되고 있으며(Bensky and Gamble, 1993), 기능성에 대한 연구로는 지사, 이뇨, 해열, 항균, 항당뇨 및 항산화효과 등이 보고되어 있다(Mukherice et al., 1995A, 1996A, 1996B, 2002, 1995B, 1995C; Hu, 2002; Jung et al., 2003; Park et al., 2010). 연자육에 대한 성분연구로는 주로 alkaloid 성분에 대한 연구가 집중적으로 행해졌으며 nuciferine, N-nornuciferine, O-nornuciferine, roemerine 등의 aporphine계 alkaloid (Luo and Yao, 2005)와 liensinine, isoliensinine, neferine 등의 phenolic alkaloid (Wu and Pan, 2004) 및 (+)-1(R)-coclaurine, (-)-1(S)-norcoclaurine 등 benzylisoquinoline alkaloid (Kashiwada et al., 2005) 성분들이 보고되고 있다. 그밖에 (+)-catechin, (+)-gallocatechin, quercetin, kaempferol 등의 flavonoid 화합물(Kim et al., 2001) 및 tryptophan, asparagin, tyrosine 등 amino acid 성분들이 보고되어 있다. 최근에는 식물 호르몬인 dihydrophaseic acid의 분리 동정되었고, 돌연변이원성에 대한 효과, 우울증의 치료에 대한 효과, 세포독성 보호효과, 심장질환 치료효과 및 항경련효과(Seo et al., 2006; Song et al., 1997; Lee et al., 2006; Kim and Oh 2009; Ann et al., 2010; Kim and Choi, 2011) 등이 보고되었다. 그러나 본 실험에 사용한 황금색연꽃의 종자에 대한 항산화 활성연구는 전무한 실정으로, 본 연구에서는 황금색연꽃의 종자 추출물 및 분획물을 이용하여 free radical 소거 효과를 통한 항산화 효과에 대해 검토하였다.
Materials and Methods
시료의 제조 및 시약
2014년에 충청남도 부여군 규암면에서 생산된 황금색연꽃(Nelumbo nucifera)의 종자 2,800.8 g을 껍질째 분쇄하여 7,000 mL의 ethanol (EtOH)로 3시간 동안 10회 반복하여 추출하여 얻어진 추출물을 모은 후, 회전식 감압농축기를 이용하여 농축하여 EtOH 추출물(232.1 g)을 얻었다. 농축한 EtOH 추출물을 물에 현탁시킨 후 n-hexane으로 분획하여 n-hexane 분획물(42.2 g)을 얻었으며, 남은 수층을 methylene chloride (MC)으로 분획하여 MC 분획물(59.1 g)을 얻었다. 또한, 남은 수층을 ethyl acetate (EtOAc)로 분획하여 EtOAc 분획물(1.4 g)을 얻고, n-butanol (BuOH)로 분획하여 BuOH 분획물 (12.4 g)을 각각 얻었다. 실험에 사용한 1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH)는 Sigma-Aldrich Co. (Missouri, USA)사의 제품을 trichloroacetic acid (TCA)는 Kanto Chemical Co. (Tokyo, Japan)사의 제품을, griess reagent는 Sigma Chemical Co. (St. Louis, USA) 제품을 사용하였으며, 추출용 용매는 모두 분석용을 사용하였다.
DPPH 소거능
농도별로 EtOH에 녹인 시료 100 μL와 60 μM DPPH 용액 100 μL를 96-well plate에 혼합하여 30분간 빛을 차단하여 실온에 방치시킨 후, 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 시료를 첨가하지 않은 대조군과 비교하여 free radical 소거 효과를 백분율(%)로 나타내었다(Hatano et al., 1989; Koleva et al., 2002).
Hydroxyl radical (∙OH) 소거능
Fenton 반응에 따라 10 mM FeSO4∙7H2O-EDTA에 10 mM 2-deoxyribose solution과 농도별 시료용액을 혼합한다음, 10 mM의 H2O2를 첨가하여 37℃에서 4시간 동안 반응하였다. 이 혼합액에 2.8% TCA와 1.0% thiobarbituric acid (TBA) solution을 각각 첨가하여 10분간 boiling한 후 cooling하여 490 nm에서 흡광도를 측정하였다(Chung et al., 1997).
Nitric oxide (NO) 소거능
각 농도별 시료는 10 mM sodium nitroprusside (SNP)와 혼합하여 25℃에서 60분간 반응하였다. 이 반응 혼합액은 96-well plate에 주입하여 griess reagent을 넣어 실온에서 15분간 반응한 후 540 nm에서 흡광도를 측정하였다 (Sreejayan et al., 1997).
O2- 소거능
50 mM PBS에 0.125 mM ethylenediamminetetraacetate (EDTA), 62 μM nitro blue tetrazolium (NBT), 98 μM NADH를 혼합한 용액을 96-well plate에 200 μL를 취하고, 50 mM의 phosphate-buffer에 녹인 각 농도별 시료 25 μL를 혼합한 후, 33 μM의 phenazine methosulfate를 혼합하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다(Ewing and Janero, 1995).
Total phenol 함량
총 phenol 함량은 Vinson et al. (1998)의 방법을 이용하였으며, 건조한 샘플을 50% methanol과 1.2 M HCl 용액에 혼합하여 90℃에서 2시간 가열 추출한 후 0.45 μm membrane filter로 여과하여 수집한 추출액은 -20℃에서 보관하며 실험에 사용하였다. 추출액 100 μL를 취하여 methanol에 희석하여 folin-ciocalteau reagent와 20% sodium carbonate와 혼합하여 23℃에서 1시간 반응한 후 760 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이 때 표준곡선은 taninic acid를 농도별로 조제하여 사용하였다.
통계분석
대조군과 각 시료들로부터 얻은 실험 결과들은 평균 ± 표준편차로 나타내었고, SAS 4.2를 이용하여 각 실험 결과로부터 ANOVA (analysis of variance)를 구한 후 Duncan’s multiple test (p < 0.05)를 이용하여 각 군의 평균 간의 유의성을 검정하였다.
Results and Discussion
DPPH radical 소거 활성법은 화학적으로 유도되는 비교적 안정한 radical로서 시료의 free radical 소거 능력이나 수소 공여능력을 평가하는 방법이다. DPPH는 cystein, glutathion과 같은 함황아미노산과 L-ascorbic acid 및 Butylated hydroxyanisole 등에 의해 환원되어 탈색되므로 다양한 천연소재로부터 항산화 능력을 알아보기 위한 측정법으로 가장 쉽고 널리 알려진 방법이다(Hatano et al., 1989; Koleva et al., 2002). 짙은 자색을 띄는 diphenylpicrylhydrazyl이 항산화제에 의해 diphenylpicrylhydazine으로 환원되면서 구조적인 변화로 인해 색깔이 사라지는 것을 540 nm의 파장에서 분광흡광계를 이용하여 관찰한다. 황금색연꽃 종자 추출물 및 분획물의 항산화 활성을 알아보기 위하여 황금색연꽃 종자 추출물 및 분획물(EtOH, Hx, MC, EtOAc, BuOH)에서의 DPPH radical 소거 효과를 살펴보았다. Table 1은 그 결과를 나타낸 것으로 100 μg/mL에서 EtOH 추출물 및 MC, EtOAc, BuOH 분획물이 모두 85% 이상의 소거능을 나타내었고, 특히 EtOAc는 96.24%로 다른 분획에 비해 가장 높은 활성을 나타내었다.
·OH은 활성산소종 중에서 가장 반응성이 크고 인접한 생체 분자에 심각한 손상을 야기하는 것으로 알려져 있다. Macrophages와 leukocytes의 phagocytosis 또한 ·OH 생성 원인이 되며, 이러한 ·OH는 fenton 반응에 의해 O2-와 H2O2로부터 생성되며, 활성질소종인 ONOO-의 분해에 의해 생성되기도 한다(Chung et al., 1997). Table 2는 황금색연꽃 종자 추출물 및 분획물의 ·OH 소거능에 대한 결과이다. 황금색연꽃 종자 추출물 및 분획물을 농도별로 처리한 결과 유의적으로 소거율이 증가하였으며 50 μg/mL에서 모두 75%이상의 ·OH 소거능을 나타내었다.
NO는 생체내에서 기질인 L-arginine이 nitric oxide synthase (NOS)의 작용으로 citrulline과 함께 생성되며 인체 면역반응과 혈관 확장에 중요한 역할을 한다. 생체내에서 과량 생성된 NO는 미토콘드리아의 기능 억제, 분자적 산소와 함께 nitrosating agent를 형성하는 자동산화 과정을 거쳐 DNA deamination을 통한 돌연변이 유발, FeS 함유 효소 기능 저하 및 각종 효소의 작용을 억제하는 것으로 알려져있다(Cui et al., 2006). 따라서 NO의 생성을 억제함으로써 항염효과 및 NO에 의한 독성으로부터 보호 효과를 기대할 수 있다(Imal et al., 1993). Table 3은 NO 소거효과를 알아보기 위해 SNP로 NO를 생성시킨 후 황금색연꽃 종자 추출물 및 분획물을 처리하여 NO 소거효과를 측정한 결과이다. In vitro에서 황금색연꽃 종자 추출물 및 분획물을 농도별로(10, 50, 100 μg/mL) 처리한 뒤 NO 소거 효과를 나타낸 결과, EtOH 추출물과 MC, EtOAc 분획물은 40% 이상의 소거 효과를 나타내는 것을 확인할 수 있었다. 특히 EtOAc 분획물은 농도 의존적으로 NO 소거능이 증가했으며 100 μg/mL 농도에서 53.25%의 가장 높은 소거능을 나타내었다.
O2- 는 활성산소 중 가장 먼저 생성되고 반응성이 약하지만 일부 분자를 직접 공격할 수 있다. 예를 들어, O2- 는 ·OH보다 훨씬 느리기는 하나 glutathione peroxidase를 불활성화 시킬 수 있으며 부분적으로 catalase를 불활성화 시킬 수 있다. 또한 O2- 는 DNA를 직접적으로 변형시키지는 못하지만 반응을 촉진할 수 있을 정도의 transition metals이 존재할 때 hydroxyl radicals 형성을 촉진한다.
2O2- + 2H+ → H2O2
Me3+ + O2- → Me2+ + O2
Me2+ + H2O2 → Me3+ + ·OH + OH-
첨가하는 항산화제의 농도에 따라 이 반응은 억제되거나 촉진된다. O2- 소거능은 NBT 환원법에 의해 O2-가 NBT에 의해 발색되는 정도를 560 nm에서 측정하였다. Table 4는 황금색연꽃 종자 추출물과 분획물의 in vitro상에서 O2- 소거 효과를 확인한 결과이다. EtOH 추출물과 EtOAc, BuOH 분획물을 처리하였을 때 30% 이상의 O2- 소거능을 나타내었다. 그 중에서 특히 EtOAc 분획물은 농도 의존적으로 O2- 소거 활성이 증가하는 것을 확인할 수 있었으며 50 μg/mL농도에서 71.46%로 O2-의 소거효과가 가장 뛰어난 것을 알 수 있었다.
식물에는 다양한 phenol성 또는 polyphenol성 화합물들이 shikimate, mevalonate 그리고 phenylpropanoid pathway를 통한 2차 생성물로 생성되어 단당류나 이당류와 결합하거나 다당류, 지질, 아민등과 복합체를 형성하여 다양한 구조나 양으로 존재하게 된다. 이러한 phenol성 화합물은 μ-electron system 주위의 delocalization에 의한 unpaired electron을 지원하고, 또한 aromatic hydroxyl group에서 활성 산소로 hydrogen 원자를 쉽게 내어줌으로써 항산화능을 나타내는 데 중요한 요인이 된다(Duthie and Crozier, 2000). Table 5는 황금색연꽃 종자 추출물 및 분획물의 총 phenol 함량을 나타낸 결과이다. Tannic acid를 표준으로 하여 나타내었을 때, EtOAc 분획물에 371.36 mg/g으로 가장 많은 폴리페놀이 존재하는 것으로 나타났다. BuOH 분획물과 EtOH 추출물의 총 폴리페놀 함량은 83.76, 50.15 mg/g이 존재하고, Hx 분획물이 9.45 mg/g으로 가장 낮은 함량이 존재함을 확인하였다.
Conclusion
본 연구에서는 황금색연꽃 종자의 항산화활성을 확인하기 위해 황금색연꽃 종자의 에탄올 추출물 및 다양한 용매 분획물을 제조하여 in vitro 항산화 활성(DPPH, OH-, NO, O2-)을 라디칼 소거능을 통해 검토하였다. 황금색연꽃 종자 추출물 및 분획물 중에서 EtOAc 분획물이 DPPH 라디칼에 대한 소거능이 뛰어났다. ·OH는 EtOH 추출물이, NO와 O2-는 EtOAc 분획물에서 높은 소거활성을 나타내었다. 또한, 채소류의 항산화 기능성과 관련이 있다고 알려져 있는 총 폴리페놀 함량도 EtOAc 분획물에서 가장 높았다. 이상의 결과로 볼 때 황금색연꽃 종자는 높은 항산화 활성을 가지며 활성산소로부터 야기되는 산화적 스트레스로 인한 질병을 예방하는 천연 항산화제로서 역할을 할 것으로 기대된다. 또한, 높은 라디칼 소거능을 보여준 EtOAc 분획물내의 항산화 성분에 관한 연구가 필요하다고 사료된다.
