Introduction
GM (genetically modified, 유전자변형) 작물은 1994년 상업화 이후 매년 지속적으로 재배면적이 증가하여, 2017년에는 24개국에서 1억 8,980만 헥타르의 면적에 걸쳐 재배되었다(James, 2018). GM 작물 중 콩(Glycine max)은 옥수수, 면화, 유채와 함께 가장 많이 재배되는 작물로 2017년에만 9개국 94.1백 만 헥타르에서 재배되어 전체 GM 작물의 49.6%를 차지하였으며, 전 세계 전체 콩 재배면적인 121.5백 만 헥타르의 77%를 차지하였다(James, 2018). 국내에는 격리된 공간에서의 시험연구용 이외에는 아직 GM 작물 재배가 허용되고 있지 않다. 하지만 식용 및 사료용 등의 용도로 2017년에만 약 9,601천 톤, 20.1억 달러의 GM 곡물이 수입되었으며, 이중 콩은 대부분 식용으로 약 1,043천 톤이 수입되었고 수입국 및 규모는 브라질 496천 톤, 미국 397천 톤, 기타 150천 톤이었다(KBCH, 2018).
현재 상업화 되어 재배되고 있는 GM 콩의 형질은 크게 두 가지로 74%가 제초제저항성(herbicide resistance)이며 나머지는 제초제저항성과 해충저항성(insect resistance)을 형질을 모두 지닌 후배교배종이다. 국내에 식품용 및 사료용으로 수입 승인된 GM 콩 이벤트는 총 28종으로 제초제저항성, 해충저항성, 지방산변화를 통한 기능성강화 등 형질을 가지고 있으며 단일 또는 복합 형질을 지고 있다(James, 2018; KBCH, 2018). 국내에서는 비타민E 강화 및 병해충저항성, 내한발 및 내염성 등 환경스트레스 저항성 콩 등이 개발되어 환경방출 실험이 진행 중에 있으나 아직 상업화에 성공한 사례는 없는 실정이다(KBCH, 2018).
GM 작물은 농업 생산량 증가와 농약사용 절감을 통한 농가 소득 증대 및 농업 환경 피해 감소, 그리고 이를 통한 온실가스 감소 등 다양한 이점이 있다고 알려져 있지만(Owen, 2000; Brookes and Barfoot, 2006; James, 2018), 유전자 전이에 따른 도입 유전자의 이동과 잡초화 가능성, 생태계 교란 등의 환경에 대한 GM 작물의 잠재적 위해성에 대한 우려도 제기되고 있는 실정이다(Ellstrand, 1992; Conner et al., 2003; Al-Ahmad and Gressel, 2006). 우리나라는 GM 작물의 안전한 이용을 위해 ’유전자변형생물체의 국가간 이동 등에 관한 법률(LMO법)’을 제정하여 시행하고 있다(Lee and Suh, 2011). LMO법에서는 GM 작물의 상용화를 위해 인체와 환경에 미칠 수 있는 요인들에 대한 철저한 안전성 평가를 요구하며, GM 작물의 근연종 및 이종 간의 교잡을 통한 도입유전자의 이동은 GM 작물의 환경위해성 평가에서 가장 중요한 항목 중 하나이다.
콩은 대표적인 자가수분 식물로 일반적인 자연환경에서의 타식율(outcrossing rate)은 0.5% 미만으로 알려져 있지만(Chiang and Kiang, 1987; Nakayama and Yamaguchi, 2002; Ray et al., 2003), 50 cm 이내의 밀식 재배와 같은 최적 교잡조건에서는 2% 이상의 타식율이 보고되기도 했다(Chiang and Kiang, 1987; Ahrent and Caviness, 1994; Ray et al., 2003). GM 콩 도입유전자의 non-GM 콩으로의 유전자이동에 대한 연구는 다양하게 수행되었다. Yoshimura et al. (2006)은 4년간의 실험을 수행한 결과 GM 콩으로부터 non-GM 콩으로의 가장 먼 거리의 교잡은 1년차에 7 m, 2년차에 2.8 m, 4년차에 3.5 m이었으며 3년차에는 교잡이 발견되지 않았다고 보고하였으며, 가장 높은 교잡율은 0.7 m 거리에서 0.19%이었다고 보고하였다. Nakayama and Yamaguchi (2002)는 GM 콩과 야생콩(G. soja)을 50 cm 간격으로 재배하였을 때 GM 콩에서 야생콩으로의 화분에 의한 교잡율이 평균 0.73%에 이른다고 보고하였다. 국내에서 수행된 연구에서 Baek et al. (2010)은 서양종꿀벌(Apis mellifera L.)이 콩의 화분을 이동시키는 것으로 보고한 바 있으며 Lee et al. (2015)은 GM 콩의 도입유전자 이동에 총채벌레와 꿀벌과 같은 화분매개충의 영향에 대한 연구결과를 보고한 바 있다.
국내에서 GM 작물로부터 교잡 가능한 식물로의 교잡 연구는 콩 이외에도 벼(Lee et al., 2007b; Lee et al., 2009a; Lee et al., 2012; Bae et al., 2013; Oh et al., 2014; Han et al., 2015; Oh et al., 2017), 고추(Kim et al., 2009a, Kim et al., 2009b), 배추(Baek et al., 2008), 양배추(Kim et al., 2014), 유채(Lee et al., 2007a; Lee et al., 2009b), 수박공대(Kim et al., 2008), 잔디(Lee et al., 2014) 등 다양한 작물에서 수행되었다.
화분에 의한 유전자이동은 일반적으로 바람과 매개충 등에 의해 일어나며, 개화시기, 재배면적, 풍속, 기후 등의 환경에 의해 영향 받는다(Warwick et al, 2009). 이러한 환경 영향뿐 아니라 화분 공급자 및 수여자의 크기 또한 유전자이동에 영향을 준다(Levin, 1981). 비록 국내외적으로 다양한 GM 작물에서 유전자 이동 연구가 수행되었으나 화분 공급자의 크기에 대한 연구는 거의 수행되지 않은 실정이다. 콩의 유전자이동 연구에 있어서 콩의 낮은 타식률 때문에 화분 공급원과 수용원을 여러 개 두어 모든 방향에서 교잡을 유도하여 진행되었다. Chiang and Kiang (1987)과 Nakayama and Yamaguchi (2002), Ray et al. (2003)은 화분(pot)을 이용하여 화분 공급원과 수용체를 한 주씩 교대로 배치하여 연구를 수행하였다. 재배구를 이용한 GM 콩의 유전자이동성 연구에서 Yoshimura et al (2006)은 22 m × 72 m 크기로 포장 4등분하여 GM 콩과 non-GM 콩을 지그재그로 배치하였으며, Baek et al. (2010)은 4 m × 4 m 크기로 GM 콩과 재배콩, 야생콩을 배치하였다. Lee et al. (2015)은 0.9 m × 5 m 크기로 GM 콩을 배치하여 재배콩과 야생콩으로의 유전자 이동을 조사하는 등 이전 수행된 콩의 유전자이동 연구에서 화분 공급원의 크기는 모두 다양하였다.
GM 작물의 안전성평가를 위해 유전자이동성 평가는 필수적인 요소이며 효율적인 평가를 위해 GM 작물의 화분원의 크기에 대한 한계치 설정과 이를 통한 안전성평가 가이드라인 개발이 요구되는 실정이다. 본 연구에서는 GM 콩을 이용하여 화분 공여체 면적의 크기에 따른 유전자이동의 변화에 미치는 영향을 조사하여 화분 공급원의 효율적 크기를 파악하고자 연구를 수행하였다.
Materials and Methods
유전자이동평가 실험재료
실험에 사용된 GM 콩은 bar 유전자를 선발마커로 사용한 비타민A 강화 형질 콩(β-PAC, SP 7-3-1)이었으며, 유전자이동 조사를 위한 화분 공급원으로 이용하였다. 이 이벤트 품종은 글루포시네이트 암모늄(BASTA) 제초제 선발이 가능할 뿐 아니라 종자에 베타카로틴이 축적되어 노란색을 나타냄으로 육안으로 교잡종을 확인 할 수 있어 유전자이동 연구에 적절한 특성을 지니고 있다. GM 콩으로부터의 화분을 수용하는 non-GM 식물체는 GM 콩의 모본인 광안콩을 이용하였다. 실험재료들은 원예용 상토를 이용하여 50공 포트에 파종 후 GMO 격리온실에서 발아를 유도한 뒤 2주간 생육 후 국립농업과학원 LMO 격리 포장(RDA-가AB-2013-041)에 정식하였다.
실험포장 및 실험구 배치
GM 콩에서의 화분 공여체 크기 별 유전자이동성 조사 실험은 국립농업과학원 농업생명자원부 격리포장에서 수행되었다. 실험구 중앙에 GM 콩을 화분 공급원으로 배치하였고 화분수용체는 화분 공급원을 중심으로 동서남북의 4방향으로 배치하였다(Fig. 1). 화분 공급원과 화분수용체의 개체 간 거리는 각각 15 cm, 줄 간 거리는 90 cm로 배치하였다.
화분 공급원 크기 별 유전자이동성 조사를 위해 GM 콩 화분원의 크기는 90 cm × 90 cm와 180 cm × 180 cm, 360 cm × 360 cm의 총 3개의 크기로 하였으며, 화분원의 크기에 따라 각각 2줄, 3줄, 5줄의 GM 콩을 배치하였다(Fig. 2). 화분 공급원인 GM 콩의 개체 수는 90 cm × 90 cm의 경우 총 14주(7주 × 2열)이며, 180 cm × 180 cm는 총 39주(13주×3열), 360 cm × 360 cm는 총 125주(25주 × 5열)이었다. 화분수용체는 동쪽과 서쪽 방향의 경우 90 cm 간격으로 3열로 배치하여 GM 콩 화분 공급원 가장자리로부터 각각 90, 180, 270 cm의 거리로 배치하였으며, 북쪽과 남쪽의 경우 15 cm의 간격으로 18주를 정식하여 최대 270 cm의 최대 거리를 갖도록 배치하였다. 화분수용체는 GM 화분 공급원의 크기에 따라 각각 2, 3, 5줄로 배치하였다(Fig. 2).
Fig. 2. The experimental design of the field trial. Genetically modified (GM) soybeans were planted in center (black rectangles) as pollen source. non-GM soybeans were planted in four directions beside GM soybeans. The size of GM pollen source was 90 cm × 90 cm (A), 180 cm × 180 cm (B), and 360 cm × 360 cm (C). (D) is photograph of the experimental field trial
GM 콩 도입유전자의 이동 조사
화분 수용체 non-GM 콩에서 수확된 종자는 제초제 선발 실험을 위해 60 cm × 90 cm × 10 cm 크기의 플라스틱 포트에 약 200립의 종자를 파종한 뒤 LMO 격리온실에서 3주간 재배하여 발아와 생장을 유도하였다. 생장이 유도된 콩에 0.4% 농도의 글루포시네이트 암모늄 제초제를 3일 간격으로 2회 처리 한 후 2주 뒤에 제초제에 저항성을 나타내는 개체를 선발하였다.
제초제로 선발된 개체에 대해 PCR 분석을 수행하였다. 선발된 개체의 잎 샘플 100 mg을 액체질소와 유발을 이용하여 곱게 갈은 후 DNeasy PowerPlant Pro Kit (QIAGEN, Germany)를 이용하여 매뉴얼에 따라 DNA를 추출하였다. PCR 분석을 위해 GM 콩의 도입유전자인 bar 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머를 이용하였으며, 대조구로 콩의 내재유전자인 lectin 유전자를 이용하였다. PCR 분석에 사용된 프라이머 정보는 bar 유전자의 경우 ’F: TCA ACC ACT ACA TCG AGA CAA GC, R: GAT AGC GCT CCC GCA GAC 이었으며 예상 증폭 크기는 105 bp이었다. lectin 유전자는 F: TGC CGA AGC AAC CAA ACA TGA TCC T, R: TGA TGG ATC TGA TAG AAT TGA CGT T 이었으며 예상 증폭 크기는 414 bp이었다. PCR 반응 조건은 94℃ 5분 후, 94℃ 30초, 55℃ 30초, 72℃ 1분의 조건에서 30 사이클로 증폭한 뒤 72℃에서 5분간 처리하여 완료하였다. 증폭된 PCR 산물은 1.5% agarose gel에서 전기영동 후 확인하였다.
Results and Discussion
화분 공급원인 GM 콩과 화분 수용체 non-GM 콩을 유전자이동성 평가 포장에 배치 후 약 5개월 간 자연적으로 개화 및 생장을 유도한 후 non-GM 콩에서 종자를 수확하였다. 유전자이동을 통한 교잡종 선발을 위해 non-GM 콩을 샘플링을 통해 선발한 뒤 그 개체의 모든 종자를 수확하였다. 콩 개체 샘플링은 동쪽과 서쪽의 경우 90, 180, 270 cm의 각 거리별로 3개체씩 무작위로 선발하여 종자를 수확하였으며, 북쪽과 남쪽의 경우 GM 화분 공급원으로부터 15 cm를 시작으로 45 cm 간격으로 총 7개체씩을 무작위로 수확하였다(Fig. 3). 샘플링 된 non-GM 콩 개체는 비닐온실에서 한 달 간 자연 건조 후 탈곡과 정선 작업을 수행하였다. 총 96개 사이트에서 수확된 종자는 총 22,719개 이었으며, 샘플링 된 한 개체 당 평균 237개의 종자가 수확되었다.
수확된 종자는 60 cm × 90 cm × 10 cm 크기의 플라스틱 포트에 약 200립의 종자를 파종한 뒤 3주간 재배하여 발아와 생장을 유도하였다. GM 콩으로부터 화분을 받아 교잡된 non-GM 콩 종자는 GM 콩에 도입된 bar 유전자를 획득하여 바스타 제초제에 저항성을 나타낸다. GM 콩으로부터 유전자가 이동된 종자를 선발하기 위해 바스타 제초제를 처리 후 2주 뒤에 제초제에 저항성을 나타내는 개체를 선발하였다. 제초제 선발은 다량의 샘플을 검정할 수 있는 장점이 있지만, 온도 및 광조건 등 생육 조건의 차이에 의해 부적합한 샘플이 선발될 가능성이 있다(Lee et al. 2015). 따라서 제초제로 선발된 개체들에 대해 정확한 유전자이동을 확인하기 위한 PCR 분석을 수행하였다. PCR 분석에는 GM 콩에 도입된 bar 유전자를 마커로 사용하였으며, 대조구로 콩의 내재 유전자인 lectin을 이용하였다(Fig. 4).
PCR 분석을 통해 14개의 개체들이 최종 선발되었다. 선발된 교잡종은 동쪽과 서쪽 방향에서 총 7개가 관찰되었으며 GM 콩의 화분 공급원 크기가 90 cm × 90 cm인 경우에는 발견되지 않았고, 화분원 크기가 180 cm × 180 cm인 경우 90 cm 거리에서 2개체, 화분원의 크기가 360 cm × 360 cm의 경우 90 cm 거리에서 4개체, 180 cm 거리에서 1개체가 확인되었다(Table 1). 발견된 교잡종의 교잡율은 0에서 0.32%를 나타냈으며, 가장 높은 교잡율(0.32%)은 360 cm × 360 cm 화분원 크기에서 화분원과 가장 가까운 90 cm 거리에서 발견되었다. 그 외 교잡발생은 약 0.1%의 교잡율을 나타냈다.
남쪽과 북쪽 방향의 경우에도 총 7개의 교잡이 확인되었다. 교잡이 발견된 거리와 개체수는 GM 콩 화분 공급원의 크기가 90 cm × 90 cm의 경우에서 화분원에서 가장 가까운 15 cm 거리에서 1개체가 발견되었고, 180 cm × 180 cm 경우는 60 cm 거리에서 1개체, 360 cm × 360 cm에서는 15 cm 거리에서 3개체와 60 cm 거리에서 2개체가 발견되었다. 남쪽과 북쪽 방향에서는 최대 교잡거리가 60 cm로 동쪽과 서쪽의 180 cm에 비해 짧았다. 교잡율은 360 cm × 360 cm 크기 화분원에서 15 cm 거리 지점에서 0.78%의 가장 큰 교잡율을 나타냈으며, 화분원의 크기가 90 cm × 90 cm이고 거리가 15 cm인 지점에서는 0.41%의 교잡율을 나타냈다.
교잡이 발생한 지점의 특징을 종합해보면 화분원의 크기가 가장 큰 360 cm × 360 cm 크기에서 전체 14개의 교잡 중 10개의 교잡체가 나타났으며, 180 cm × 180 cm 크기에서는 3개, 90 cm × 90 cm 크기에서는 1개의 교잡체가 발생하여 화분원의 크기가 클수록 교잡이 많이 발생한 것으로 판단되었다. 또한 교잡은 화분원에서 가장 가까운 거리(동쪽과 서쪽의 경우 90 cm, 남쪽과 북쪽의 경우 15 cm)에서 가장 많이 발생한 것으로 나타났으며, 가장 먼 거리의 교잡 발생은 180 cm이었다(Table 1, 2). 교잡이 발생한 개체와 방향성에 대한 특별한 상관성은 관찰되지 않았다.
Ray et al. (2003)은 GM 콩으로부터 non-GM 콩으로의 교잡 연구에서 GM 콩 화분원으로부터 0.9 m의 거리에서 0.41%의 교잡율을 보였고, 최대 5.4 m의 거리에서 0.03%와 0.05%의 교잡을 나타냈다고 보고하였다. Yoshimura et al. (2006)은 GM 콩으로부터 non-GM 콩으로의 교잡은 0.7 m에서 약 0.1%의 교잡율을 나타냈으며 최대 7 m에서 0.04%의 교잡이 관찰되었다고 보고하였다. Chiang and Kiang (1987)은 재배콩 사이에서 10 cm의 거리에서 0.737%의 교잡율을 확인하여 보고하였다. 이들 기존 연구결과들과 비교할 때 본 연구에서 관찰된 GM 콩과 non-GM 콩 간의 교잡율은 큰 차이를 보이지 않았다. 하지만 최대 교잡 거리에 있어서 본 연구에서는 180 cm까지만 관찰되어 500 - 700 cm의 다른 연구보고에 비해 짧았다. 이러한 결과는 콩에서 화분을 통한 교잡은 바람, 기온 등 다양한 환경에 영향을 받으며, 특히 벌(Chiang and Kiang, 1987; Ray et al., 2003), 총채벌레(Nakayama and Yamaguchi, 2002) 등 화분 매개충의 영향이 큰 것으로 알려져 있어 이들 생물 및 비생물적 영향에 의한 가능성이 제기되었다.
본 연구에서 GM 콩 화분원 크기에 따라 교잡 가능성의 증가 가능성이 큰 것으로 조사되었으나 교잡 개체의 수가 비교적 작아 통계적 유의성을 확보하기 위한 지속적인 데이터 확보 또한 필요할 것으로 사료되었다. 또한 콩의 낮은 교잡율과 특히 먼 거리에서의 낮은 교잡율을 확인하기 위해 조사 샘플 수를 더 증가 시킬 필요성이 있다고 사료되었다. 본 연구에서는 화분 공급원과 수용체의 맞닿은 면적을 증가시켜 교잡율을 높이기 위해 GM 콩 화분 공급원의 넓이에 따라 화분 수용체의 거리는 동일하게 유지하면서 넓이를 증가시켰다(Fig. 2). 화분원의 크기에 상관없이 화분 수용체 크기를 동일하게 할 경우 화분원 크기의 효과가 더 명확히 관찰될 수 있는 가능성이 있다. 하지만 이러한 경우 화분원의 크기에 따라 수용체 식물과의 교잡 거리가 달라지고, 특히 거리에 따라 콩의 교잡율이 급격하게 낮아지는 특성 때문에 교잡율 확인에 어려움이 있을 것으로 판단되었다(Yoshimura et al., 2006). 효율적인 GM 콩의 유전자이동성평가를 위한 GM 콩 화분원의 크기에 대한 한계치 설정과 이를 통한 안전성평가 가이드라인 개발은 국내 생명공학작물 연구에 있어 매우 유용한 항목이다. 이러한 유전자이동성 평가를 위한 효율적 화분 공급원 크기 도출은 기상 및 화분 매개충 발생 유무 등 다양한 지역적, 환경적 변수가 포함되어야 하기 때문에 다양한 유사 연구가 지속적으로 수행되어야 한다. 본 실험 결과는 GM 작물의 유전자이동성 평가에 있어 화분 공급원의 크기에 대한 기초 자료로 크게 활용될 것으로 기대한다.
Conclusion
GM 작물은 세계적으로 재배면적이 지속적으로 증가하고 있으며, 이에 따른 GM 작물의 잠재적 위해성에 대한 우려도 증가되고 있는 실정이다. 현재까지 국내에서 GM 작물의 상업적 재배는 되고 있진 않지만 GM 작물의 안전성평가를 위한 기술개발은 크게 요구되고 있는 실정이다. 국내외적으로 다양한 GM 작물의 유전자이동성 평가가 수행되어왔으나 화분 공급원인 GM 작물의 재배 크기에 대한 연구는 부족한 실정이다. 본 연구에서는 화분 공여체의 면적 크기에 따른 GM 콩 도입유전자가 모본인 non-GM 콩으로 이동하는데 있어 차이를 조사하였다. 실험구의 설계는 GM 콩을 화분공급원으로 가운데에 배치하고 non-GM 콩을 화분수용체로 4개 방향으로 배치하였으며, 이때 화분원의 크기를 90 cm × 90 cm, 180 cm × 180 cm, 360 cm × 360 cm의 3개의 크기로 하였다. non-GM 콩으로부터 22,719립의 종자를 수확하여 제초제 선발과 PCR 분석을 통해 최종적으로 14개의 교잡종을 얻었다. 가장 높은 교잡율은 0.78%로 360 cm × 360 cm 크기 화분원에서 15 cm 거리 지점에서 발생하였으며, 가장 먼 교잡거리는 360 cm × 360 cm 크기 화분원에서 180 cm 거리에서 확인되었다. 화분원의 크기가 가장 큰 360 cm × 360 cm 크기에서 전체 14개의 교잡 중 10개의 교잡체가 발견되었으며, 180 cm × 180 cm 크기에서는 3개, 90 cm × 90 cm 크기에서는 1개의 교잡체가 발생하여 화분원의 크기가 클수록 교잡이 많이 발생할 가능성이 클 것으로 판단되었다. 본 실험 결과는 GM 작물의 유전자이동성 평가에 있어 화분 공급원의 크기에 대한 기초 자료로 크게 활용될 것으로 기대한다.
