Introduction
돼지는 인간에게 중요한 동물성 단백질 공급원이며, 등지방 두께와 근내지방 함량은 상업용 시장에서 선별 기준으로 고려되는 육질에 영향을 미치는 주요 인자로 알려져있다(Borchers et al., 1997; Gerbens et al., 2001). 이와 관련하여 등지방 두께는 육량을 증가시키기 위해 등지방을 얇게 개량하는 외국의 선호도와 달라서, 등지방을 증가시키거나 더 이상 얇아지지 않도록 유지하려는 개량 방향으로 다시 개량하는 형질 중 하나이다. 돼지 등지방 두께는 일반적으로 피하지방이 많지만 견부와 요부에 두텁게 부착되어 등의 중심부의 지방은 엷고 일정하게 부착되어 등급 규격에서는 제 11 - 12 늑골 부위와 마지막 늑골과 첫번째 요추 사이에서 등지방 두께를 측정하여 평균치를 내여 지육평가의 기준으로 하고 있다.
Yorkshire 품종은 베이컨형으로 육성되었으나, 근래에는 육용형(Meat type)으로 개량되어 육질이 양호하다. 장점은 번식능력과 포유능력이 우수하며 Landrace 종 또는 Duroc 종과 교배에 의해서 생선된 1대 잡종은 산자능력이 우수하여 3원 교잡종 생산을 위한 모계로 널리 사용되고 있다.
최근 한국재래돼지(Korean Native pig, KNP)와 Landrace 교배에서 육질 및 등지방 두께와 관련된 양적형질좌위(Quantitative trait loci, QTL)가 돼지 염색체(Sus scrofa chromosome, SSC) SSC6, SSC8에 보고 되었으며(Lee et al., 2012; Kang et al., 2016), ryanodine receptor 1 (RYR1), obesity-associated (FTO), prostaglandin I2 synthase (PTGIS), nuclear protein 4 (NOL4) 등의 유전자들이 육질 및 지방축적과 연관되어 있다고 보고 되었다(Fujii et al., 1991; Fontanesi et al., 2009; Li et al., 2011). 또한 KNP × Landrace 교배집단에서 등지방 형질과 연관된 QTL 영역(SW1482 - SW963)을 보고 하였으며(Yoo et al., 2012), 이 영역에 포함하는 glutamate receptor-interacting protein 1 (GRIP1) 유전자를 위치상 후보유전자로 보고하였다(Lee et al., 2017).
본 연구에서는 Yorkshire를 이용하여 등지방 두께와 관련된 유의적인 genome 상의 위치를 확인하고, 개량에 도움을 줄 수 있는 위치상 후보유전자 탐색을 하고자 실시하였다.
Materials and Methods
공시 동물 및 DNA 추출
농협 종돈장에서 1755두의 모근을 제공 받아 genomic DNA 를 분리 하였다.
등지방 두께 형질 측정
Yorkshire 축군 1755두의 등지방 두께 측정은 검정종료시에 한번 측정을 하고 초음파 A mode를 이용해서 측정하였다. 어깨(제4늑골), 등(최후늑골), 허리(최후요추) 이렇게 세 곳을 측정하고 평균을 사용하였으며 아래의 식으로 보정하였다.
보정된 등지방 두께 = 측정시 등지방 두께 + ((90 kg - 종료체중)×측정시 등지방 두께/(종료체중 - 11.34)) (1)
통계분석에 앞서 측정된 형질은 MINITAB 프로그램(Minitab Inc., USA)에서 구현이 되는 Ryan-Joiner 방법(Ryan and Joiner, 1976) 을 이용하여 normality test를 실시하고 이상치를 제거하였다.
Genome-Wide association Study
돼지의 gDNA를 Porcine Single Nucleotide Polymorphism (SNP) 60K bead chip (Illumina, USA)를 이용하여 61,565개의 SNP 유전자형 분석을 실시하였다. Plink 프로그램 version 1.07 (, Purcell et al., 2007)을 이용하여 Minor allele frequency (MAF) < 0.05, genotyping error > 0.1, Hardy-Weinberg equilibrium (p-value ≤ 0.000001) 순서대로 SNP marker들을 제거하여 최종적으로 45,214개의 SNP marker를 GEMMA v0.93 (, Zhou and stephens, 2012) 프로그램에서 제공되는 일변량선형혼합모형 옵션을 이용하여 각각의 양적 형질에 대하여 전장유전체관련성분석을~ 수행하였다. GEMMA를 이용하면 집단 및 샘플의 구조를 보정한 Genome-Wide Association Study (GWAS)를 수행 할 수 있다. GWAS를 수행하기 위한 통계모형은 다음과 같다.
y = Wα + xβ + u+ ϵ; u ~ MVNn(0, λτ − 1K), ϵ ~ MVNn(0, τ − 1In) (2)
여기서, y 는 형질 측정치 벡터이고, W는 성별, 농장, 배치, 종료체중 및 1로 구성된 열을 포함한 고정효과 공변량 행렬이며, α는 절편을 포함하는 해당 계수 벡터이며, x는 유전자형 벡터이고, β는 각 marker들의 효과의 크기를 나타낸다. u는 임의 효과 벡터로서 다변량정규분포를 따르는데 여기서 τ-1는 잔차의 분산이며, λ는 τ-1 와 잔차 간의 비율이며, K는 상염색체상의 SNP marker를 이용해서 계산한 유전체관계행렬을 나타내며, ϵ는 잔차벡터로서 다변량정규분포를 따르며 In는 항등행렬이다.
Genome-wide 임계수준(suggestive threshold level)은 Bonferroni method (1/SNP marker의 수; p = 1.61 × 10-5)를 이용하였다. 2, 14, 18염색체에서 탐지된 등지방 두께와 연관된 후보유전자는 NCBI database (http://www.ncbi.nih.gov)를 이용하여 탐색하였다.
Results and Discussion
Yorkshire 집단 1,755두 중 결측치와 이상치를 제외한 1,642두의 생시체중 평균값과 표준편차는 1.4714 ± 0.2521 cm이고, 최소값은 0.83 cm, 최대값은 2.31 cm 이었다(Table 1). 한국재래돼지에서 등지방 두께는2.098 ± 0.431, KNP × Landrace 축군에서 F2는 2.293 ± 0.6897로 보고 하였다(Yoo et al., 2012; Kim and Kim, 2017).
Porcine SNP 60 K beadchip 분석을 통하여 총 61,565개의 SNP 중 MAF 0.05 이하 49,439개, genotyping error 0.1 이상 49,113개, Hardy-weinberg equilibrium (p-value) 0.000001 이하 48,150개, 최종적으로 42,214개 상염색체의 SNP marker를 확인 하였으며, SNP marker와 등지방 두께 형질 사이의 관련성 분석을 통하여 SNP marker의 Manhattan plot과 Quantile-quantile (QQ) plot을 작성하였다(Fig. 1). 순종 축군의 조합은 선발과 교차에 의하여 이루어지기 때문에 교잡 축군의 조합으로 이루어진 축군에 비해 변이가 적은 특성을 가지고 있다. 이에 다중 비교시 생길 수 있는 오류를 보정하는 방법인 Bonferroni correction (Bland and Altman, 1995)을 적용하여 Genome-wide suggestive (1/42,214 = 2.37 × 10-5)를 적용한 결과 4.63 (- log10p)의 값을 나타내었다(Lander and Kruglyak, 1995).
Fig. 1. Manhattan plots (A) and quantile-quantile plots (B) of the GWAS for back fat thickness. The x-axis shows the physical positions of the SNP markers on the pig chromosomes and the association signal on the y-axis (shown as - log10p). The Manhattan plots show the identification for back fat thickness trait on SSC2, 14, 18. GWAS, Genome-Wide Association Study; SNP, Single Nucleotide Polymorphism; SSC, Sus scrofa chromosome.
등지방 두께 형질과 관련하여 유의적 임계수준(genome-wide suggestive level)을 만족하는 SNP marker는 염색체 2, 14, 18번에서 동정되었다. 2번 염색체에서 1개의 SNP marker [MARC0053928 (p = 3.65 × 10-6)], 14번 염색체에서 2개의 SNP marker [ALGA0083078 (p = 7.85 × 10-6), INRA0048453 (p = 1.27 × 10-5)], 18번 염색체에서 1개의 SNP marker marker [ALGA0120564 (p = 1.44 × 10-5)]가 동정되었다(Table 2). 유의적인 p-value를 가지는 SNP marker들에 대하여 가장 근접해 있는 유전자를 위치상 후보 유전자로 선정하였으며, 2번 염색체의 MARC0053928 SNP marker [potassium voltage-gated channel subfamily Q member (KCNQ1)], 14번 염색체의 ALGA0083078 [dedicator of cytokinesis 1 (DOCK1)], INRA0048453 (LOC106506151), 18번 염색체의 ALGA0120564 (LOC110257583) 각각의 위치상 후보유전자로 선정되었다. KCNQ1은 potassium channel protein으로 심장 활동 전위의 재분극 단계에 필요한 voltage-gated potassium channel을 위한 단백질을 암호화하고 있다(Jespersen et al., 2005). KCNQ1의 변이는 여러 형태(Long QT syndrome, Short QT syndrome 및 가족성의 심방세동)의 부정맥으로 이어질 수 있는 것으로 보고되어있다(Hedley et al., 2009). Okamura et al. (2012)는 일본의 일반 인구 표본에서 KCNQ1과 body mass index (BMI) 사이에 유의한 연관성을 발견하였고, Benton et al. (2015)은 KCNQ1 유전자를 비만 및 Type-2 diabetes과 관련된 유전자로 제시하였다. 또한 DOCK1은 폐, 신장, 복부피하지방 뿐 아니라 여러 조직에서 흔히 발현하는 유전자이다(Li et al., 2017). Wallner et al. (2014)는 부분적 상관관계 분석으로 DOCK1이 지질과 특히 plasmalogen의 항상성을 조절하는데 관여 할 수 있는 새로운 잠재적인 핵심 부분으로 제시하였다. Vaughan et al. (2015)은 비만 관련된 형질의 새로운 유전적 표지자를 밝히기 위한 연구에서 사람의 10q26.13 - 10q26.2 region이 adiponectin과 triceps skinfold (삼두근 피부주름)과 관련이 있는 것으로 보고하였고, 이 영역에서 TOPP 유전자는 potential candidate genes인 DOCK1을 확인하는 유일한 알고리즘인 것으로 확인하였다. LOC106506151, LOC110257583은 유전자의 기능에 대한 정보가 없었다.
등지방 형질과 관련하여 KNP × Landrace 교배집단에서 보고된 QTL은 5번 염색체에서 Yoo et al. (2012)이 SW1482 - SW963 영역에 위치한다고 보고 하였으며, Lee et al. (2017)은 이 영역에서 GRIP1 유전자를 위치상 후보유전자로 보고하였다.
Strucken et al. (2014)은 마지막 늑골의 등지방과 연관된 QTL을 1번 염색체와 유의 하다고 보고 하였으며, 5번 18번 염색체에서 Ribani et al. (2017)은 엉덩이 부근의 등지방과 관련된 QTL을 보고하였다. Schiavo et al. (2014)은 Large white 품종에서 등지방 두께 평균 형질의 QTL은 8, 11, 12, 13, 14, 15, 16번 염색체를 보고하였다. 이와 같이 등지방 관련 형질이라는 공통점이 있었음에도 본 연구의 결과와 차이를 보였던 원인은 여러가지가 있을 수 있는데 품종, 표본수, 교배 방식등의 차이와 등지방 두께의 측정 부위와 보정식의 차이 때문으로 사료되며, Park et al. (2016)의 내용에 따르면 포유기간 동안 등지방 손실이 발생하여 성별 또한 등지방 두께에 영향을 미치는 것 으로 사료된다.
