Introduction
식물 정유는 다양한 식물에서 추출한 복합 방향족 화합물로 알려져 있다(Pinto et al., 2009; Singh and Chittenden, 2010). 식물 정유는 가정에서 일상적으로 사용되는 천연물로 많이 알려져 있으나 항균 활성, 항 염증, 항산화 등의 다양한 특성으로 전통의학 및 가축산업에서 많이 사용되었다 (Pinto et al., 2009; Singh and Chittenden, 2010; Park et al., 2016). 이러한 식물 정유의 항균 특성에도 불구하고 작용기작이나 효과에 대한 자료가 거의 제한적이거나 일관성 있게 알려진 것이 적다. 특히, 식물병원균에 대한 항균 활성 보고는 많이 보고되지 않았다(Pinto et al., 2009). 그 중 호주의 토종 식물인 Melaleuca alternifolia에서 추출한 tea tree oil (TTO)이 휘발성 식물 정유로 알려져 있으며, 열대지역에서 오랫동안 살균성 물질로 사용되어 왔다(Markham, 1999).
TTO는 수십 가지 이상의 성분을 지닌 혼합물이며(Zabka et al., 2014), 대부분이 monoterpenes과 sesquiterpense이거나 이들 물질과 관련된 알콜성 물질로 구성되어 있다(Brophy et al., 1989). 그 중에 TTO의 주요성분인 terpinen-4-ol이 살균효과가 매우 뛰어난 것으로 알려져 있다(Southwell et al., 1993; Carson and Riley, 1995; Oliva et al., 2003; Terzi et al., 2007). 이러한 항균 효과로 인해 TTO를 함유한 제품들이 상업적으로 제조-판매되고 있으나 제조사별로 제품에 대한 살균력에는 큰 차이가 없는 것으로 나타났다(Carson and Riley, 1994).
TTO의 항균 활성에 대한 2000년도 초-중반에 다시 주목을 받기 시작하였고(Allen, 2001; Carson et al., 2006), 이러한 TTO의 항균 활성 능력은 세균 및 진균(곰팡이)의 세포 호흡을 저해하고 세포막의 물질 이동성을 저해하는 것으로 알려졌다(Carson et al., 2006). 예를 들면 TTO는 식품을 변질시키거나 식물에 병을 일으키는 곰팡이인 Aspergillus fumigatus, Fusarium solani, Fusarium culmorum, Penicillium expansum, Botrytis cinerea와 Rhizopus oryzae의 포자발아 및 균사의 생장을 억제하거나 호흡을 저해하는 효과가 있다고 보고되었다(Gatti et al., 1992; Bishop and Reagan, 1998; Inouye et al., 1998; Bowers and Locke, 2000; Inouye et al., 2000; Angelini et al., 2008). Cox et al. (2000)은 대장균인 Escherichia coli와 황색포도상구균인 Staphylococcus aureus와 같은 인체에 해로운 세균 및 효모에서도 항균효과가 있음을 보고하였다.
또한 Hammer et al. (2002)의 보고에 따르면 TTO는 발아되지 않은 포자보다 발아된 포자에서 더 강한 살균력을 가지고 있으며, 이는 TTO가 포자 발아 억제 및 살 진균작용을 모두 가지고 있음을 보여준다. 하지만 이와 같은 살균력이외에도 Kapros and McDaniel (2009)는 TTO가 세균과 곰팡이의 세포막뿐만 아니라 담배 식물의 세포막도 투과하여 식물에도 피해를 줄 수 있다고 보고하였다. 따라서 TTO가 항균 활성 및 식물에 해를 주는 것으로 알려져 있기 때문에 이를 농업에 적용하기 위해서는 방제 효과 및 약해에 대한 특성 조사도 매우 필수적이고 중요하다고 판단하였다.
따라서 본 실험에서는 토마토와 메론 작물의 시설재배 시 다 발생하는 네 가지 서로 다른 병원 진균을 대상으로 in vitro 항균 활성 능력과 in vivo 포장 검정을 통하여 TTO의 항균활성 및 방제 능력을 검정하였고, 이는 실질적인 농가에서의 친환경 농업에 활용하고자 연구를 수행하였다.
Materials and Methods
공시 균주
본 실험에서 사용한 공시 균주 중 Botrytis cinerea, Passalora fulva는 부여지역의 토마토 재배 포장에서 채집한 이병조직으로 분리하였고, Pseudocercospora fuligena는 천안 지역의 토마토 재배 포장에서 분리하였다. 또한 Phytophthora infestans는 평창 지역의 감자 재배 포장에서 채집한 병든 잎에서 분리하여 시험에 사용하였다. 분리한 모든 균주는 기주 식물을 대상으로 병 검정을 통해 병원성 유무를 확인한 후 다음 실험에 이용하였다.
오일 농도
Tea tree oil의 농도에 따른 항균 활성을 조사하기 위하여 살균된 potato dextrose agar (PDA) 배지에 tea tree oil (TTO)을 0.1, 0,2, 0.5, 1.0 및 2.0%의 농도가 되도록 배지에 첨가한 후 petri-dish에 분주 하였다. 또한, 포장에서 엽면 살포시 tea tree oil의 엽면 부착율을 높이기 위해 전착제를 이용하기 때문에 본 배지 시험에서도 tween 20 (Sigma, St Louis, MO, USA)를 첨가하였고, 농도는 0.5%가 되도록 하였다. 무처리 배지에도 동일한 농도의 tween 20을 첨가하여 사용하였다.
in vitro 균사 생장 억제 효과 조사
TTO의 항균 활성 효과를 조사하기 위하여, TTO가 농도별로 첨가된 PDA 배지 중앙에 공시한 모든 병원 균주의 균총(8.0 mm)을 접종한 후 배양기에서 배양하면서 균사 생육 억제 정도를 측정하였다. P. infestans는 생육적온 인 20 ± 1℃에서 배양하였고, 나머지 3 균주는 25 ± 1℃에서 배양하였다. 각 균주는 생장속도에 차이점이 있기 때문에 배양 기간을 조절하면서 균사 생육을 조사하였다. B. cinerea는 7일간, P. infestans는 10일간, P. fulva와 P. fuligena는 20일간 배양한 다음 균사생육 억제율을 조사하였다. 모든 실험은 처리당 3개 배지, 3반복으로 실시하였고, 다음과 같은 방식으로 억제율을 계산하였다.
(1)
In vivo 병 발생 억제 및 약해 조사
충청남도 부여군 소재 과채연구소에 있는 단동 온실(시설재배)에서 토마토(품종명: TY high Q, NONGWOO BIO, Suwon, Korea)와 멜론(Earl's Talent, NONGWOO BIO, Suwon, Korea)을 대상으로 2019년 8월 25일부터 동년 10월 20일까지 TTO처리에 의한 병 발생 억제 및 치료효과 실험을 실시하였다. 토마토 품종은 40공으로 된 연결포트에서 35일간 육묘하였고, 멜론은 25일간 육묘 한 후 암면(그로단)에 정식하였다. 시험기간동안 배양액은 PBG (proefstation voor Bloemisterij en Glasgroente)액으로 관주 처리하였다. In vivo 병 발생 억제 및 방제 효과를 조사하기 위해 멜론에 발생하는 흰가루병과 토마토에 발생하는 잎곰팡이병과 흰가루병(순활물 기생균)은 인위적으로 접종하지 않고 시설재배에서 자연적으로 발생되기 때문에 TTO 약효 조사에 활용하였다. 특히, 두 병원균에 의한 병 발생 초기 인 2019년 9월 10일경에 TTO를 1차 처리한 후 7일 간격으로 3회 엽면에 살포하여 처리하였으며, 이 시기에 일교차에 의해 위에 기술한 병원균들의 발생 양상이 양호하여 살균효과를 검정하기에 적절한 조건이 형성되었다. 무처리구는 0.5% tween 20을 동일한 방법으로 처리하였다. 병 방제효과는 TTO를 최종적으로 처리한 후 7일째에 다음과 같이 병반면적율을 조사하여 방제효과를 계산하였다.
(2)
발병지수: 0 무발생, 1 병반면적율 5% 이하, 2 병반면적율 5.1 - 20%, 3 병반면적율 20.1 - 40%, 4 병반면적율 40.1% 이상
(3)
본 실험도 약효 검정과 동일하게 9월 10일부터 7일 간격으로 3회 엽면 살포하였다. 잎에 나타나는 이상 증상으로 약해 유무를 판단하였다. TTO의 농도는 0.5, 1.0, 2.0%로 조절하여 실시하였다.
(4)
통계분석
통계분석은 SAS (Statistical Analysis System Ver. 9.1, SAS Institute Inc., Cary, NC, USA)을 이용하였으며 처리 간 유의성 검정은 Duncan의 다중검정(Duncan’s multiple range test, p = 0.05)으로 실시하였다.
Results and Discussion
TTO의 in vitro 균사생장억제 효과
TTO이 in vitro상에서 항균 활성 효과를 조사하기 위하여 과채류에 병을 일으키는 4종류의 병원균인 B. cinerea, P. fulva, P. fuligena 및 P. infestans을 공시하여 균사 생육 억제 효과를 PDA 배지 상에서 측정하였다. 항균 활성 조사를 위해 TTO의 농도에 0.1, 0,2, 0.5, 1.0 및 2.0%로 조절한 후, In vivo 조사 시 엽면 부착율을 높이기 위해 tween 20을 0.5%가 되도록 함께 첨가하여 수행하였다. 앞서 재료 및 방법에 기술한 바와 같이 각각의 병원균의 균총을 배지에 접종한 후 P. infestans는 생육적온 인 20 ± 1℃에서 배양하였고, 나머지 3 균주는 25±1℃에서 배양한 후 균사 생육 억제 정도를 조사하였다(Fig. 1). 그 결과 토마토 재배 시 발생하는 잿빛곰팡이병균(B. cinerea은 TTO농도 0.2, 및 1.0%에서 각각 80.0 및 95.0% 이상의 균사 생장 억제를 보였고(Fig. 1A and Fig. 2A), 잎곰팡이병균(P. fulva)은 TTO 농도 0.2%에서 83.0, 0.5%에서 97.0% 균사 생성이 억제되었다(Fig. 1B and Fig. 2B). 검은잎곰팡이병균(P. fuligena)은 TTO 농도 0.2%에서 95.0, 0.5%에서 98.0%로 균사 생장이 강하게 억제되었다(Fig. 1C and Fig. 2C). 또한 토마토와 감자에 역병을 일으키는 P. infestans도 TTO 농도 0.1%에서 94.0, 0.2%에서 96.0%로 균사 생장이 억제되는 것을 확인하였다(Fig. 1D and Fig. 2D).
이와 같은 결과는 Bishop and Reagan (1998)이 TTO가 양배추 잿빛곰팡이병균 B. cinerea 방제에 효과적이라고 보고하였고, Gatti et al. (1992)은 2% TTO가 들어있는 PDA 배지에서 F. graminearum의 균사 생장이 80% 억제되었다고 보고 하였다. 또한, 주요 식물병원균에 대한 TTO의 최소 살균 농도는 Alternaria spp. 0.06 - 2.0%, Cladosporium spp. 0.12 - 4.0%, Penicillium spp. 0.5 - 2.0%, Fusarium spp. 0.25 - 2.0%, Rhodotorula rubra 0.5%, Saccharomyces cerevisiae 0.5%, Trichosporon spp. 0.12%, Malassezia furfur 0.5 - 1.0%, Malassezia sympodialis 0.06 - 0.12%라고 알려져 있다(Hammer et al., 2000, 2002, 2003). TTO에 의한 균사 생장 억제 효과는 병원균에 따라 농도의 차이가 있는 것으로 보고되었고, 본 실험에서도 공시한 병원균들 간에 농도에 차이가 있었으나 균사 생육 억제효과가 강하게 보이는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 1 and Fig. 2). 결과적으로 TTO는 본 실험에서 사용한 4종의 모든 식물병원균에 대해 강한 균사 생육 억제효과를 보였기 때문에, 추 후 시설재배에서 발생하는 모든 식물병원진균에 적용할 필요가 있으며, 세균병균에 대해서도 확대 할 가치가 있다고 판단된다.
Fig. 1. Effect of tea tree oil (TTO) on mycelium growth of four phytopathogenic fungi on potato dextrose agar (PDA). (A) Botrytis cinerea, (B) Passalora fulva, and (C) Pseudocercospora fuligena were grown at 25 ± 1℃ for 7 days (B. cinerea, and 20 days [P. fulva and P. fuligena]), respectively. Phytophthora infestans was also grown at 20 ± 1℃ for 10 days (D). Each TTO concentration was 0.1, 0.2, 0.5, 1.0, and 2.0%, respectively. Control plates were 0.5% tween 20 alone.
Fig. 2. Effect of tea tree oil (TTO) on mycelial growth of (A) Botrytis cinerea, (B) Passalora fulva, (C) Pseudocercospora fuligena, and (D) Phytophthora infestans on potato dextrose agar (PDA) containing different concentration of TTO. Data are presented as means with standard deviations of three individual plates. a - d: Means carrying same letters in a graph are not significantly different (p = 0.05) according to Duncan’s multiple rang test.
TTO 처리에 의한 시설 재배내 발생하는 식물병의 방제 효과
TTO 처리에 대한 시설 재배 내에서 발생하는 멜론의 흰가루병을 방제하기 위하여 TTO 0.5%를 함유한 액상을 7일 간격 3회 엽면 살포한 결과, 흰가루병의 방제 효과가 85.0% 수준으로 나타났고, 0.3와 0.25% 처리에서는 65.0와 60.0%의 방제 효과를 보였다. 이 결과는 TTO의 농도에 따라 방제 효과에 차이가 있는 것을 보여주는 것으로 농도에 의존하는 것으로 나타났다(Table 1; Fig. 3).
또한, 작물의 적용 확대를 위하여 TTO 0.5%를 토마토에 엽면 살포가 결과 메론의 흰가루병의 결과와 유사하게 토마토 잎곰팡이병에 대해서도 방제 효과가 81.0% 수준이었으며, 0.3%과 0.25%에서 각각 60.0%와 57.0%의 방제 효과를 나타났다. 결과적으로 멜론 및 토마토 작물에 발생하는 흰가루병과 잎곰팡이병에 대한 TTO의 방제 효과는 0.5% 이상의 농도에서 병 방제에 매우 효과적이라고 판단되었다(Table 1; Fig. 3). 이는 Blumeria graminis가 일으키는 맥류의 흰가루병에 대한 친환경적 방제를 위해 in vitro 실험에서 보여주었던 맥류의 잎에 TTO를 처리하였을 때 흰가루병의 감염이 감소한 결과와 유사하였다(Terzi et al., 2007). 또한 Morcia et al. (2011)도 B. graminis를 대상으로 한 in vitro 및 In vivo 실험에서도 TTO 처리가 매우 효과적이라고 보고 하였다. 따라서, 본 실험에서 확인된 멜론의 잎에 발생하는 흰가루병의 억제도 TTO 처리에 의한 흰가루병균의 균사 생장을 억제하여 방제 효과가 증가했을 것으로 추정된다(Table 1; Fig. 3).
Fig. 3. Effect of tea tree oil (TTO) treatment on the powdery mildew of melon and leaf mold of tomato plants. Melon and tomato plants were grown in plastic houses at 25 ± 2℃ after spray with 0.5% of TTO solution for 3 times on every 7 days. Disease severity was measured 7-days after the final treatment of TTO solution. (A) Comparison of melon and (C) tomato leaves sprayed with 0.5% of TTO treatment (in 0.5% tween 20) on (B) melon and (D) tomato leaves, respectively. Control plants were spray with 0.5% tween 20. Typical disease symptoms of the powdery mildew of melon (A, white circle) and leaf mold of tomato (C, red circle) plants.
TTO의 농도별 처리에 의한 메론 및 토마토 잎에서의 약해 조사
앞서 TTO 처리에 의한 멜론과 토마토에 발생하는 흰가루병 및 잎곰팡이병에 대한 방제 효과를 확인한 후, 이를 현장에 적용하기 위해 동일 작물에 대한 TTO의 약해 검정을 진행하였다. 본 실험을 위해 TTO의 농도를 0.5, 1.0%와 2.0%로 조절하여 멜론의 잎에 7일 간격으로 1회부터 3회까지 분무 살포한 후 약해 발생 수준을 관찰하였다. 그 결과 멜론의 잎에 1.0% TTO를 7일 간격으로 1회 처리 시 피해엽율은 15.0%, 2회 35.0%, 3회 처리 시는 56.0% 수준으로 처리 횟수가 늘어날수록 약해가 심해지는 것이 확인되었다. 또한, TTO 농도를 2.0%로 높였을 때에는 3회 처리시 98.0% 수준으로 급격히 증가하는 경향을 나타내었다. 반면에 TTO를 토마토의 잎에 동일한 농도로 분무 살포한 경우를 보면, TTO 1.0% 처리시에는 처리 횟수에 상관없이 약해가 관찰되지 않았다. TTO 2.0%를 토마토 잎에 분무 살포하였을 경우 1회 처리 시 15.0%, 2회 처리시 27.0%, 3회 처리 시 34.0%로 피해엽율이 증가하는 경향을 보였다(Table 2; Fig. 4). 본 실험에서 보여주는 결과로 볼 때 TTO를 현장에 적용할 경우 멜론의 경우에는 농도가 1.0%였을 때 약해가 발생하였으나 0.5%에서 약해가 없는 것으로 관찰되었다. 따라서 멜론의 경우에는 0.25%로 조절하여 처리하는 것을 권장하며, 토마토의 경우에는 1.0% 농도까지 처리할 수 있을 것으로 판단하였다.
TTO처리에 의한 멜론 및 토마토 잎에 나타난 약해 발생은 TTO가 세균과 곰팡이의 세포막뿐 만 아니라 담배 BY-2 세포의 세포막도 투과하여 피해를 준다는 보고와 일치되는 결과라고 추정된다(Kapros and McDaniel, 2009). 따라서 병해 방제용으로 TTO를 포장에 직접적으로 적용할 경우에 토마토는 1.0% 이하, 멜론은 0.5% 이하의 처리가 약해 피해 없이 병 방제 효과가 현저하게 증가하는 것으로 확인되었다(Table 2; Fig. 4). 또한 TTO 농도에 따른 약해 피해 정도가 두 작물사이에서 차이가 있었으므로 타 작물로 적용을 확대하고자 하는 경우에는 정확한 처리 농도의 설정과 처리 방법에 대한 매뉴얼 제시가 요구된다.
마지막으로, 지금까지 TTO처리에 의한 병원균의 생장 억제 및 병 발생 억제 효과에 대한 보고는 많이 알려져 있지 않다(Gatti et al., 1992; Bishop and Reagan, 1998; Inouye et al., 1998; Bowers and Locke, 2000; Inouye et al., 2000; Angelini et al., 2008). 더욱이 본 실험에서 공시한 멜론의 흰가루병 및 토마토의 잎곰팡이병에 대한 병 방제 효과도 아직까지 보고된 바가 없기 때문에 이에 대한 효과를 구명하고자 하였다. 연구결과에 의하면 멜론과 토마토 재배에 있어서 천연물질인 TTO 0.5%를 작물보호제 처리 방법과 유사하게 3회 처리하면 멜론 흰가루병 및 토마토 잎곰팡이병에 대하여 80% 이상의 방제 효과를 얻을 수 있었다. 따라서 시설재배 포장에서 멜론과 토마토의 병해 발생을 억제하기 위하여 TTO를 사용할 수 있을 것으로 사료된다. 또한 B. cinerea, P. fuligena 및 P. infestans에 대한 균사 생장 억제에서 나타났듯이(Fig. 1) 이들 병원균에 의해 유발되는 다양한 병 방제에도 효과가 있을 것으로 추정되며, 앞으로 시설 재배 포장에 적용하는 등의 확대 연구가 필요할 것이다.
Fig. 4. Phytotoxic symptoms of tea tree oil (TTO) treatment on melon and tomato leaves (red circle). Melon and tomato plants were grown in plastic houses at 25 ± 2℃ after spray with TTO solution for 3 times on every 7 days. Phytotoxicity was measured 7-days after the final treatment of 1.0% and 2.0% TTO solution, respectively. (A) 1.0% of TTO treatment on tomato leaves, (B) 2.0% of TTO treatment on melon leaves.
Conclusion
식물정유는 식물에서 추출한 항균제로 알려져 있지만 병원균에 대한 EO의 효능을 조사한 연구는 제한적이다. 그중 TTO은 Melaleuca alternifolia에서 추출하였으며 항진균제로도 사용된다. 본 연구에서는 Podosphaera xanthii에 의한 멜론 흰가루병 억제와 Passalora fulva에 의한 토마토 잎곰팡이병 억제에 대한 TTO의 효과를 조사하였다. 흰가루병 및 잎곰팡이병은 각각 TTO의 분무 처리에 의해 현저하게 억제되었다. 0.5% TTO를 멜론과 토마토 잎에 7일 간격으로 3번 분무 처리하였을 때, 흰가루병의 80%와 잎곰팡이병의 81%가 억제되었다. 하지만, 멜론의 경우 1% TTO 처리에서 약해가 발생하였기 때문에 0.25% 농도로 조절하여 사용하는 것이 바람직하다. 또한 4개의 서로 다른 병원 진균에 대한 균사생육억제 정도를 조사한 결과, TTO의 농도에 따라 영향을 주는 것으로 확인되었다. P. fuligena의 98%, P. fulva의 97%, Botrytis cinerea의 95% 및 Phytophthora infestans의 94%가 각각 0.2%에서 1.0%까지 함유된 배지에서 균사생육이 억제되었다. 그러므로, 우리의 연구결과는 TTO가 작물재배 중에 발생하는 다양한 식물병원균에 대해 높은 항진균 효과가 있음을 시사하였다. 또한 TTO를 식물 잎에 처리할 때 다양한 작물에 대한 정확한 처리 농도를 설정 해야한다고 제안하였다.
